Endosimbiosis (2): Rhizobium, a medio camino de organelas celulares
La vida es compleja, compleja de narices para qué nos vamos a engañar. Una sola célula es un batiburrillo molecular que a menudo recuerda a una factoría en miniatura. Y en el mundo celular, el súmmum de la complejidad radica en la célula eucariota. Este tipo de célula es el que compartimos todos los animales, todos los vegetales, todos los hongos y todos los protistas (una amalgama de seres unicelulares, libres o coloniales, que a veces recuerdan a animales, otras a plantas, otras a quien sabe qué).
El origen de la célula eucariota ha sido objeto de debate en el mundo científico durante décadas, incluso aún hoy lo sigue siendo y en parte, todavía es un misterio. Sin embargo, como ya sabrán muchos de nuestros lectores, uno de los mayores avances en este campo se lo debemos a la microbióloga estadounidense Lynn Margulis, autora de la Teoría de la Endosimbiosis Seriada, según la cuál, los componentes más complejos de estas células, las mitocondrias y los cloroplastos, no son otra cosa que antiquísimas bacterias que fueron asimiladas como simbiontes y que han terminado como las organelas que vemos hoy día.
Sin embargo, ¿Cómo una relación tan íntima puede darse? ¿Y más aún si nos basamos en los “egoístas” criterios de la evolución mediada por la Selección Natural, originalmente postulada por Darwin? ¿Y cómo sería un caso intermedio entre una bacteria de vida libre y una organela celular? ¿Se conoce algún ejemplo hoy día de algo tan estrafalario? Bueno, puede que sí 😀
El problema del nitrógeno.
El nitrógeno es un elemento fundamental para la vida, es un componente esencial de los ácidos nucleicos y las proteínas, de diversas actividades enzimáticas e incluso es un componente estructural de ciertos tipos de glúcidos (azúcares) y lípidos (grasas). Y sin embargo, es un elemento tan difícil de obtener como importante.
Esto se debe a que el nitrógeno molecular (N2), la forma más pura y abundante del nitrógeno (representa hasta el 75% de la composición de la atmósfera), es tan estable que no reacciona con apenas nada, ni siquiera con la bioquímica de los organismos. ¿Cómo de inerte es el nitrógeno molecular, N2? Pues mucho, sin ir más lejos nosotros, para poder fabricar amoniaco (NH3) a partir de N2 precisamos poner en marcha una reacción química tan sencilla como la siguiente:
N2 (g) + 3 H2 (g) ↔ 2 NH3 (g) (ΔH = −92.4 kJ·mol −1)
No se asusten, traducida viene a decir que teniendo una molécula de nitrógeno gas y tres moléculas de hidrógeno gas, en determinadas “condiciones especiales” podemos obtener dos moléculas de amoniaco gas liberando en el proceso una importante cantidad de calor. El problema es que estas “condiciones especiales” requieren de óxido de hierro para catalizar la reacción, presiones de 15-25 MPa (150-250 atmósferas más o menos) y temperaturas del orden de 300-550º C (para más información, pulsar aquí). Este escenario tan infernal es suministrado por el proceso Haber-Bosch, cuyas bases fueron sentadas por el químico alemán Fritz Haber en 1909 y que le valieron para ganar el premio Nóbel de Química en el año 1918.
No es de extrañar que los seres vivos se vean obligados a utilizar otras formas de nitrógeno, llamadas reducidas y que son mucho más escasas y reactivas. Se trata del amoniaco (NH3), los nitratos (NO3–) y los nitritos (NO2–), que se encuentran de forma natural en muchos ambientes y son asimilados por las plantas, entrando así en la red trófica.
Si alguna vez os habéis preguntado por qué los fertilizantes agrícolas son tan ricos en nitrógeno, ahí tenéis razón, el nitrógeno reducido es útil para el mundo verde pero su escasez supone un freno al crecimiento vegetal. Además en el suelo existen bacterias que, al igual que nosotros respiramos oxígeno, ellas respiran estas formas reducidas del nitrógeno; y al igual que nosotros liberamos CO2, ellas liberan nitrógeno molecular (N2), que vuelve a la atmósfera. En definitiva, si estos compuestos tan difíciles de fabricar no son reciclados, son eliminados por acción bacteriana … Visto así, ¿cómo es que aún no se han agotado?
Rhizobium y la endosimbiosis.
Los compuestos reducidos de nitrógeno, como el amoniaco (NH3), los nitratos (NO3–) y los nitritos (NO2–), son tan importantes para el crecimiento vegetal como escasos en el medio ambiente, y por ello son consumidos rápidamente en cuanto están disponibles. Sin embargo, en la naturaleza existe una importante razón por la cual, estos compuestos reducidos de nitrógeno no se han agotado todavía: son sintetizados continuamente gracias a diversos géneros de bacterias. ¿Acaso esperabais otra cosa? 😀
Tanto en el medio acuático como en el terrestre existe una importante amalgama de microorganismos capaces de convertir el nitrógeno molecular en compuestos reducidos del mismo, este proceso recibe el nombre de fijación del nitrógeno.
Para conseguir esto, las bacterias emplean una batería de enzimas (proteínas con la capacidad de facilitar ciertos tipos de procesos químicos), que trabajan juntas conformando el llamado complejo nitrogenasa, que mediante el consumo de energía química son capaces de sintetizar amoniaco a partir del N2. Posteriormente otras bacterias, como por ejemplo Nitrosomonas y Nitrobacter, oxidan el amoniaco convirtiéndolo en nitritos y nitratos, respectivamente y que pueden ser usados por las plantas.
Pero si hay algún grupo particularmente interesante de fijadores de nitrógeno, ese es el de los rizobios, bacterias habitantes del suelo que establecen relaciones simbióticas muy íntimas con las leguminosas, ese grupo de plantas que incluye a nuestras lentejas, habichuelas, garbanzos, habas, guisantes, etc. (Ref. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15). ¿Hasta que punto son íntimas estas relaciones? Pues hasta el punto de que los rizobios llegan a perder su propia independencia.
No es ningún secreto que en las raíces de las legumbres existen unos abultamientos denominados nódulos. Estos nódulos están formados por densos paquetes celulares. Y dentro de estas células, sí, intracelularmente, encontramos a los rizobios. Pero no vemos a esas simpáticas bacterias de vida libre del suelo, sino algo muy diferente, encontramos un tipo de organela de gran tamaño llamada bacteroide, totalmente dependiente de la planta y cuya función es la fijación del nitrógeno atmosférico. ¡Un segundo! ¿Organelas? ¿Pero no estábamos hablando de bacterias que vivían libres en el suelo? Sí, y ese es el quid de la cuestión: son bacterias, son organelas y son el mismo organismo. ¿No queríais conocer un ser a medio camino de organela y de bacteria de vida libre? 😀
Los rizobios pertenecen al grupo de las α-proteobacterias, un grupo de bacterias en el que también encontramos patógenos intracelulares como Rickettsia y al que, además, presumiblemente pertenecen nuestras mitocondrias. Entre los rizobios encontramos 76 especies repartidas en 13 géneros, donde los más importantes son Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Ensifer y Bradyrhizobium (Ref. 7). Aunque según algunos autores, si hay tantas especies de rizobios como de leguminosas, este número podría elevarse hasta 18.000 (Ref. 14).
<<OFF TOPIC: α es una letra griega llamada alfa>>>
Su ciclo vital es bastante llamativo, si bien, para exponerlo simplificaremos bastante y nos valdremos de un caso de libro, el del rizobio Sinorhizobium meliloti, que establece simbiosis con la alfalfa (Medicago sativa L.). El crecimiento de las raíces implica el desarrollo de pelos radiculares (esos que absorben el agua) y la liberación de una serie de sustancias, los flavonoides. Para nuestras bacterias estos compuestos son una señal que avisa de la cercanía de una raíz, por lo que reaccionan a ella gracias a una serie de genes, los genes Nod, encargados de la síntesis de una colección de moléculas llamadas factores Nod (Ref. 6).
Estos factores Nod provocan que el ápice (la punta) del pelo radicular se curve sobre sí mismo, formando una especie de “cuchara” sobre la que pueden asentarse y multiplicarse las bacterias. Pero no acaba aquí la cosa. Ahora las bacterias inician su penetración en el pelo radicular y cuando lo consiguen, inducen la formación de un canal en el interior del pelo llamado canal de infección. Este canal es una autovía que traslada a las bacterias directamente hasta las células de la raíz. Una vez las bacterias las alcanzan, los factores Nod rematan la faena provocando el crecimiento y multiplicación de estas células de la raíz, dando lugar a la formación del nódulo (Ref. 6).
Y ahora es cuando se avecina otro momento clave. Una vez llevada a cabo la infección, las bacterias son introducidas (o las bacterias se introducen) en el interior de las células vegetales, en un proceso denominado endocitosis, que básicamente consiste en el envolvimiento de la bacteria por la membrana plasmática de la célula vegetal. Una vez esto ha sido llevado a cabo, tenemos a las bacterias en el interior celular y envueltas en una membrana que ahora rebautizamos como membrana peribacteroidal o simbiosomal (Ref. 6).
A partir de ahora, para la bacteria el mundo será diferente. En unos casos esta aumentará de cuatro a siete veces su tamaño original, pudiendo adoptar forma de «Y». Bajo control de la célula vegetal también pueden realizar rondas múltiples de multiplicación. Su cantidad de DNA puede multiplicarse por tres, mientras que su contenido en RNA caerá en picado. Será mucho más vulnerable a los choques osmóticos (es decir, a los cambios de concentración de sustancias en el agua).
En cualquier caso, finalmente iniciará la síntesis de nitrogenasas, incrementará sus defensas contra el oxígeno, cesará su capacidad de multiplicación, no podrá alimentarse por su cuenta y estará bajo el control del núcleo de la célula vegetal (Ref. 6 y 10).
Se acaba de convertir en un bacteroide, que como las mitocondrias y los cloroplastos antes que él, se trata de un orgánulo celular altamente especializado incapaz de volver a su condición de bacteria de vida libre. De ese modo, cuando muera la planta, el rizobio, ahora bacteroide, morirá con ella, como cualquier orgánulo celular (si alguien desea ampliar más sobre este proceso, puede mirar aquí: Ref. 6, 8 y 10). Así, una sola célula de rizobio puede tener hasta 1010 descendientes en un solo nódulo (Ref. 3). Un bonito ejemplo de altruismo… ¿O no? 🙄
¿Incompatibilidad con el “darwinismo”?
Desde la publicación del famoso libro “El Origen de las Especies”, hace ya 150 años, la Biología Evolutiva ha evolucionado y radiado bastante. Hoy el principal pilar de esta rama de la ciencia lo constituye la Teoría Sintética, cuyo germen se fundó en los descubrimientos realizados por los naturalistas británicos Alfred Russel Wallace y Charles Darwin: la Selección Natural y el cambio gradual a lo largo del tiempo; pero incorporando para sí los avances en genética, ecología, bioquímica, etc. Y para la moderna Síntesis, estas simbiosis plantean retos muy interesantes y difíciles de solventar. En primer lugar, si los bacteroides son orgánulos celulares incapaces de volver a su condición inicial de bacterias capaces de reproducirse… ¿Cómo se conserva la genética y la regulación genética de la simbiosis si esta no puede pasar de una generación a la siguiente? Después de todo, para nuestros rizobios culminar la “simbiosis” significa firmar una cadena perpetua. ¿O quizás no?
En realidad esto no pasa así siempre, en las plantas de los géneros Lotus, Glycine (soja) o Phaseolus (judías), los bacteroides tienen la posibilidad de revertir a su anterior condición de bacterias de vida libre si la planta muere, lo cual nos libra en cierto modo de la problemática de cómo la genética de los más eficientes bacteroides puede ser heredada (Ref. 2).
Pero en los géneros Medicago (alfalfas), Trifolium (tréboles) y Pisum (guisantes) los bacteroides solo vuelven a su condición inicial muy raramente, por lo que tenemos el mismo problema que antes… Salvo por el hecho de que todos los rizobios de un nódulo son clones de uno o unos pocos rizobios originales, lo que implica que tanto los bacteroides como los rizobios de un determinado nódulo son idénticos genéticamente. Si además, tenemos en cuenta que siempre hay un porcentaje de clones que no se convierten en bacteroides, ya hemos solventado este primer problema: estos rizobios libres (genéticamente idénticos a los bacteroides) son el puente con la siguiente generación (Ref. 2, 4 y 13).
Lo cuál además nos ayuda a resolver un segundo reto. Nosotros tenemos aquí un caso de altruismo recíproco: los rizobios invierten mucha energía en fijar el nitrógeno para la planta, mientras que la planta suministra oxígeno y nutrientes a los rizobios para fomentar su desarrollo. Según los criterios de la moderna Síntesis, esto es inviable evolutivamente a corto-medio plazo. Por organismos egoístas podemos considerar a aquellos que reciben todas las atenciones de los altruistas (nutrientes y oxígeno) pero que no realizan el esfuerzo de corresponder a la planta (fijando el nitrógeno), al no realizar tal gasto de energía, todo egoísta gozará de un superávit de energía que nunca tendrán los altruistas. Por ello, bastaría la aparición de un solo egoísta para que estos se multiplicaran dominando la población de rizobios en pocas generaciones. Siendo esto así… ¿Cómo es que todavía existen cepas de rizobios que participan en esta simbiosis?
<<NOTA: Los términos “egoísta” y “altruista” que emplearemos son descripciones de comportamientos, no implican que estos animales piensen “voy a ser egoísta” o algo así. Y por favor, absténganse de extraer conclusiones de moralidad humana a partir de estos casos que se dan en la naturaleza>>
Bueno, evolutivamente una solución es castigar a los “egoístas”. De hecho el ejemplo más famoso de algo así lo vemos en los murciélagos vampiro (Desmodus rotundus E. Geoffroy, 1810). Estos quirópteros se nutren de la sangre de otros vertebrados, como no es un alimento fácil de conseguir quedarse una noche sin comer es habitual. Lo cual es un problema, ya que aguantan poco tiempo antes de morir de inanición. Por ello, si un individuo se queda hoy sin comer, puede pedirle a un compañero que le regurgite un poco de alimento, algo que este hará gustosamente. Pero si este individuo no corresponde a un compañero cuando precise de ayuda, la actitud del egoísta no será olvidada y se le negará todo auxilio cuando este lo necesite. De ese modo, se cierra el grifo a la perpetuación de las actitudes egoístas. ¿Puede suceder algo semejante entre los rizobios y las leguminosas? Podría ser… 🙄
Las legumbres, aunque puedan parecer lo contrario al ser tan modositas y calladas, ejercen un totalitario y férreo control sobre quienes intentan asociarse con ellas. Las leguminosas son capaces de bloquear la entrada a cepas parásitas de rizobios (que de hecho existen). También se ha observado que si tenemos nódulos en los que habitan rizobios mutantes incapaces de fijar el nitrógeno, las plantas reaccionan liberando unas enzimas (llamadas hidrolasas ácidas) para destruir a estos ineficientes nódulos y a los rizobios que aloja (Ref. 2). Y también son capaces de asfixiar e intentar matar de hambre a aquellas cepas de rizobio que pretendan ser poco productivas, en estos casos la legumbre puede bloquear el suministro de oxígeno y nutrientes proporcionalmente a la caída de productividad de sus rizobios (Ref. 2, 3, 4 y 13).
En este sentido, la estrategia de la planta es asegurar su propio éxito, ya que se ha calculado que al menos el 99.95 % de los rizobios viables del suelo se encuentran en los nódulos (Ref. 13). Así, la buena salud del nódulo pende de la eficiencia de los bacteroides fijando nitrógeno. Y en un nódulo sano encontraremos más rizobios libres (genéticamente idénticos a estos bacteroides tan eficientes) que puedan servir de puente para con la siguiente generación, que en uno no-sano. Por ello, no es descabellado pensar que las legumbres realmente están cultivando sus propios microbios, al favorecer el crecimiento de los «curritos» y al castigar duramente a los “parásitos” (impidiendo su proliferación), interviniendo de este modo y de forma directa sobre la evolución de este grupo de microorganismos (Ref. 2, 4 y 13).
Sin ir más lejos, en experimentos de laboratorio publicados en la prestigiosa revista Nature, se ha confirmado que en los nódulos a los que se les impide la fijación del nitrógeno, la masa y número de rizobios viables es inferior a la de los nódulos que fijan el nitrógeno con eficiencia, aún compartiendo la misma planta (Ref. 5).
Finalmente, no solo tenemos el punto anterior sino la propia complejidad que implica esta simbiosis ¿Tal complejidad puede ser explicada como un proceso gradual o requerimos de algo más? En realidad los rizobios no conforman de un grupo monofilético, sino que los recientes estudios moleculares han demostrado que en realidad pertenecen, dentro de las α-proteobacterias, a grupos bacterianos muy diferentes.
Esto nos muestra algo inquietante: esta estrategia simbiótica ha aparecido y con la misma genética varias veces en la evolución… Es decir, sabemos gracias a los estudios genéticos que los rizobios no forman un linaje único y que han tenido un origen múltiple. Y por otro lado, sabemos que los genes «de la simbiosis» en principio sí forman un linaje único y han aparecido una sola vez. ¿Contradictorio? Pues sí, bastante ¿Es un golpe mortal a la Biología Evolutiva? Ni de lejos.
Es que resulta que en el mundo microbiano es pan de cada día otra potente fuerza evolutiva: La Transferencia Horizontal de Genes (Ref. 14); que viene a ser la transferencia de paquetes de genes de un individuo a otro, sea o no de la misma especie. Y de hecho, esta es el principal modelo a tener en cuenta para explicar la evolución de estos microorganismos. Un ejemplo claro es el de Mesorhizobium loti, que establece simbiosis con algunos tréboles. Se ha visto que la batería genética que le permite la simbiosis se encuentra en una isla genética, un conjunto de genes con capacidad de saltar e integrarse en otros genomas, un caso de libro de transferencia horizontal de genes (aquí tenemos una entrada muy chachi sobre estas entidades genéticas).Como colofón, experimentando en laboratorio se ha visto que estos genes “de simbiosis” pueden saltar desde Mesorhizobium loti a otras tres especies de Mesorhizobium no simbióticas (Ref. 11).
Con los genes Nod sucede un tanto de lo mismo. Su filogenia no se corresponde con la de los 16S rRNA, fragmentos de RNA útiles para establecer este tipo de relaciones. Lo cual implica que los genes Nod también han sufrido de múltiples eventos de transferencia horizontal desde los rizobios hasta otros grupos bacterianos, convirtiéndolos así en potenciales nuevos rizobios. Lo cual además es una muestra de que la endosimbiosis se ha dado múltiples veces a lo largo de la evolución en las α-proteobacterias (Ref. 12).
Ahora bien ¿Qué inicios tuvo esta simbiosis? ¿Supone un salto insalvable o puede explicarse mediante una «gradación»? ¿Es algo con la propiedad de la Complejidad Irreductible?… Son muchas preguntas con mucha tela que cortar, así que como este tema por sí solo da para una entrada completa y dado que aún me queda bibliografía por navegar, solo daremos un par de pinceladas que de por sí, ya dicen bastante 😉
Por qué a estas bacterias les dió por volverse simbiontes o no, es un tema en discusión. En el suelo las interacciones entre los organismos son muy intensas, así que más tarde o más temprano una relación para bien o para mal entre bacteria y raíz debiera darse. En cualquier caso, los modelos más antiguos de simbiosis los encontramos en las leguminosas de la subfamilia Caesalpinioideae; en ellas no tenemos nódulos, ni bacterias intracelulares, sino que encontramos bacterias fijadoras de nitrógeno que simplemente habitan entre los espacios intercelulares del córtex de la raíz (Ref. 9). En otras palabras, que se acomodan a lo que hay sin más cambios.
En otros casos de la misma subfamilia, como en el género Cassia, o en los géneros Andira o Hymenolobium de la subfamilia Papilionoideae, encontramos al igual que en el caso anterior, bacterias fijadoras de nitrógeno que habitan en los espacios intercelulares (es decir, no penetran en el interior de las células vegetales) que existen en el córtex de la raíz. Pero hay una diferencia clave, estas bacterias sí que inducen la formación de una estructura semejante a un nódulo (Ref. 9).
En la subfamilia Papilionoideae también encontramos a Arachis y Stylosanthes. ¿Os acordáis de que para poder entrar en el interior de la raíz los rizobios inducían la formación de un «canal de infección»? Pos’bueno, en estos casos «ancestrales» esto no pasa, sino que penetran en el interior de la raíz gracias a roturas en la epidermis, como vulgares parásitos. Y al igual que en el caso anterior, permanecen en los espacios intercelulares (tampoco aquí tenemos simbiontes intracelulares) e inducen la formación de un nódulo; eso sí, más semejante al de los rizobios que en el caso anterior (Ref. 9).
Definitivamente, incluso algo tan complejo como esta simbiosis puede tener etapas intermedias y graduales de complejidad, plenamente funcionales.
Los rizobios. Microorganismos a medio camino de organelas celulares. Esa pieza del puzzle situada entre la libre bacteria de toda la vida y la mitocondria, ese orgánulo intracelular presente en casi todos los eucariotas. Solo que en este caso, se trata de una organela altamente especializada en la captura de ese elemento tan fundamental para los seres vivos como el nitrógeno. Hemos visto además cómo esta estrategia puede ser heredada en la siguientes generaciones, cómo las leguminosas evitan que sus simbiontes se rebelen contra ellas y cómo pudo ir evolucionando este complejo modo de vida mediante pasos graduales. En definitiva, un maravilloso ejemplo de organismo transicional y de evolución que podemos admirar en vivo y en directo. En cualquier caso, como siempre digo, son requeridos más estudios 😉
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[continuación de la serie en: Endosimbiosis (3): Los midiclorianos y su extraña relación con las mitocondrias].
Entradas relacionadas:
- Nuestra serie: entendiendo la evolución
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BONUS TRACK.
REFERENCIAS
- 1.- Deacon, J. The Microbial World: The Nitrogen cycle and Nitrogen fixation. Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh
- 2.- Denison, R. F. (2000) Legume Sanctions and the Evolution of Symbiotic Cooperation by Rhizobia The American Naturalist, Vol. 156, No. 6 (Dec., 2000), pp. 567-576. Artículo completo disponible aquí.
- 3.- Denison, R. F. y Kiers, E. T. (2004) Lifestyle alternatives for rhizobia : mutualism, parasitism and forgoing symbiosis. FEMS Microbiology Letters 237 (2004) 187-193
- 4.- Denison, R. F. y Kiers, E. T. (2004) Why are most rhizobia beneficial to their host, rather than parasitic? Microbes and Infection 6 (2004) 1235-1239
- 5.- Kiers, E. T. et al (2003) Host sanctions and the legume-rhizobium mutualism. Nature 425, 78-81 (4 September 2003) | doi:10.1038/nature01931; Received 9 May 2003; Accepted 18 July 2003. Artículo completo disponible aquí.
- 6.- López-Lara, I. M. Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas. Asociación Mexicana de Microbiología.
- 7.- New Zealand Rhizobia – Rhizobia taxonomy.
- 8.- Oke, V. y Long, S. R. (1999) Bacteroid formation in the Rhizobium-legume symbiosis. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:641-646
- 9.- Provorov, N. A. et al (2002) Developmental Genetics and Evolution of Symbiotic Structures in Nitrogen-fixin Nodules and Arbuscular Mycorrhiza. Journal of Theorical Biology (2002) 214, 215-232
- 10.- Spaink, H. P. et al (1998) The rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria. Springer, 1998 ISBN 0 792351800, 9780792351801, 566 páginas
- 11.- Sullivan, J. T. y Ronson, C. W. (1998) Evolution of Rhizobia by Acquisition of a 500-kb Symbiosis Island that Integrates into a Phe-rRNA Gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 95, No. 9 (Apr. 28, 1998), pp. 5145-5149
- 12.- Suominem, L. et al (2001) Identification and Structure of the Rhizobium galegae Common Nodulation Genes: Evidence for Horizontal Gene Transfer. Molecular Biology and Evolution (18:907-916)
- 13.- West, A. et al (2002) Sanctions and mutualism stability: why do rhizobia fix nitrogen? Proc Biol Sci. 2002 April 7; 269(1492): 685–694. Artículo completo también disponible aquí.
- 14.- Young, J. P. W. y Haukka, K. E. (1996) Diversity and Phylogeny of Rhizobia. New Phytologist, Vol. 133, No. 1 (May, 1996), pp. 87-84
- 15.- Zahran, H. H. (2001) Rhizobia from wild legumes: Diversity, taxonomy, ecology, nitrogen fixation and biotechnology. Journal of Biotechnology Volume 91, Issues 2-3, 4 October 2001, Pages 143-153