Este texto de Félix Goñi apareció originalmente en el número 2 de la revista CIC Network (2007) y lo reproducimos en su integridad por su interés. El artículo, con todas las figuras que lo ilustran, se puede encontrar gratuitamente aquí [PDF].
En el siglo XXI estamos asistiendo al rápido desarrollo de técnicas que nos permiten observar, “ver”, directamente las moléculas que conforman los seres vivos, incluso en la célula, su entorno natural. Este conjunto de técnicas se conoce en inglés como molecular imaging y se puede agrupar en tres categorías: la microscopía de fuerza atómica, las técnicas de seguimiento de partículas individuales o single particle tracking y el gran grupo de técnicas basadas en la fluorescencia.
Microscopía de fuerza atómica o AFM
La microscopía de fuerza atómica (AFM, de sus siglas en inglés) es una técnica que permite obtener imágenes con resolución igual al nanómetro —el nanómetro es la milésima parte del micrómetro—, incluso menos, por medio de una nanosonda que va recorriendo (“barriendo”) la superficie de la muestra. La AFM es, por lo tanto, una técnica de scanning o barrido. El microscopio de AFM consta de una aguja (tip, stylus) muy afilada, montada en el extremo de un pequeño voladizo (cantilever) que permite el movimiento vertical de la guja a medida que ésta va “barriendo” la superficie de la muestra. Un transductor piezoeléctrico localiza la aguja en la superficie. La detección se consigue por un haz de láser enfocado sobre el voladizo y que se refleja en un fotodiodo. Los “accidentes” (moléculas) que encuentra la aguja en su barrido hacen subir o bajar el voladizo, y eso causa un cambio en la posición del haz reflectado en el fotodiodo que, a su vez, permite elaborar un mapa topográfico de la superficie.
La AFM encuentra una importante aplicación biológica en los estudios de las membranas celulares. Las membranas se disponen sobre soportes planos inertes, por ejemplo mica, bañadas en una solución fisiológica a temperatura controlada. Las proteínas de las membranas aparecen como protuberancias cuyas irregularidades son detectadas por la aguja. Hay imágenes obtenidas a partir de los complejos fotosintéticos de la bacteria Rhodospirillum, que muestran cambios estructurales con la intensidad de la luz. Esto es posible gracias al mínimo tratamiento requerido por las muestras biológicas para su examen por AFM; en muchos casos, basta con depositar unos pocos microlitros de la muestra sobre la superficie de mica o vidrio.
La AFM se aplica también a muestras de DNA y RNA, a moléculas de proteína —como el colágeno—, al análisis de complejos de proteína y ácido nucleico, a cromosomas y a otros biomateriales; tiene, asimismo, aplicaciones no biológicas —nanotubos, etc— que no vamos a citar. También las células vivas han sido objeto de estudio por AFM, de manera que se ha conseguido, por ejemplo, observar, en tiempo real, los movimientos de células epiteliales en migración.
Estudios recientes han conseguido imágenes de AFM de células vivas situadas no sobre un soporte rígido, sino suspendidas entre dos compartimentos acuosos. Esto abre el camino a numerosos estudios fisiológicos sobre fenómenos de transporte y de excitación eléctrica, sobre todo por la posibilidad de variar a voluntad la composición química de la disolución de cada compartimento.
Seguimiento de partículas individuales o SPT
Esta técnica, que se designa abreviadamente SPT por las siglas de su nombre en inglés, utiliza la videomicroscopía combinada con el procesamiento digital de imágenes para observar el movimiento de una molécula en un plano. La necesidad de que la molécula se mueva, sobre todo, en dos dimensiones, hace que la técnica sea particularmente útil para el estudio de las moléculas que componen las membranas celulares. Las moléculas se hacen visibles uniéndolas a partículas de tamaño inferior a un micrómetro por medio de anticuerpos o ligandos específicos. Por ejemplo, para observar moléculas la proteína CD4, que es la molécula a la que se une el virus del SIDA en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un anticuerpo anti-CD4 —obtenido de manera independiente inmunizando un conejo con CD4—, unido por métodos bien establecidos a esferitas de látex (0,2 – 0,5 micrómetros de diámetro) o a partículas de oro coloidal (0,04 – 0,1 micrómetros). Como las partículas son mucho más pequeñas (1.000 y 10.000 veces más pequeñas) que la longitud de onda de la luz utilizada en el microscopio, dispersan la luz, y la luz dispersada permite su localización con una precisión de unos 0,01 micrómetros. Es el mismo fenómeno por el cual las partículas de polvo se nos hacen visibles a la luz del sol que atraviesa una ventana, sólo que en nuestro caso hemos seleccionado, por medio del anticuerpo, un solo tipo de molécula, y dentro de ese tipo de molécula, por medio del microscopio, sólo unas moléculas concretas.
Las imágenes del vídeo se procesan en tiempo real. El software debe ser capaz de detectar una partícula individual sin confundirla con otras, y tener la flexibilidad suficiente como para permitir cambios en la estructura aparente de la partícula cuando ésta se desenfoca ligeramente. El análisis de la trayectoria de una partícula se lleva a cabo determinando, en cada imagen del video, las coordenadas (x,y) de la partícula, y calculando los desplazamientos a intervalos regulares de tiempo. La SPT permite distinguir entre movimiento browniano, confinamiento y flujo dirigido de las moléculas en las membranas. Por mencionar sólo dos ejemplos, estudios de SPT han permitido observar cómo ciertos receptores olfativos quedan inmovilizados en la superficie celular cuando se unen a una molécula odorante y forman, junto con otras moléculas de la membrana, un complejo que inicia la transmisión de la sensación olfativa al cerebro. También se ha demostrado que la difusión de proteínas del complejo principal de histocompatibilidad se retrasa cuando la concentración de colesterol en la membrana disminuye.
Fluorescencia y sus aplicaciones
Las moléculas de las sustancias coloreadas absorben constantemente cuantos de energía luminosa en el intervalo del espectro electromagnético correspondiente a la luz visible. Merced a la energía absorbida, hay electrones que acceden a un nivel energético excitado. En la mayoría de los casos, el retorno a la situación basal (relajación) se produce por pérdida de energía no radiante (calor). Sin embargo, en algunos casos las moléculas pueden relajarse emitiendo energía luminosa, a una frecuencia ligeramente menor que la luz incidente. Esta emisión se llama fluorescencia, y tiene numerosas aplicaciones en la obtención de imágenes en biología. A veces, las propias moléculas biológicas son fluorescentes, como es el caso de las proteínas. Otras veces, las biomoléculas se modifican ligeramente para unirlas a grupos químicos fluorescentes. El resultado, en cualquier caso, es que podemos excitar la fluorescencia de moléculas específicas y observar su localización en el interior de la célula. Debido a la utilidad de este fenómeno, en los últimos años se ha desarrollado una plétora de técnicas fluorescentes aplicadas a la imagen biológica, de las que daremos aquí sólo unos pocos ejemplos.
Fluorescencia y microscopía confocal.
En un microscopio convencional, la totalidad de la muestra se ilumina con la luz de una lámpara de xenon o de mercurio. Como las muestras biológicas son normalmente más gruesas que el plano focal, la imagen contiene una aportación importante de luz desenfocada, lo que perjudica su calidad. En el microscopio confocal, la muestra se ilumina barriendo con un haz de luz enfocada, generalmente un láser. El haz de luz se hace incidir en un punto de la muestra por medio del objetivo, y se mueve lateralmente en el plano de la muestra mediante un sistema mecánico controlado por ordenador. Las secuencias de puntos de luz de la muestra se detectan en un tubo fotomultiplicador a través de un pequeño agujero (pinhole), y el ordenador las convierte en imagen. La función del agujero es eliminar la luz no enfocada. Aunque la microscopía confocal se puede aplicar a muestras fijadas y teñidas con los procedimientos histológicos habituales, la utilización de la fluorescencia permite obtener imágenes de células vivas intactas.
La microscopía confocal produce, en principio, la imagen de un plano —lo que se llama una sección óptica—. Enfocando la muestra en distintos puntos del eje z se obtiene una serie de secciones ópticas de alta resolución, que pueden utilizarse para reconstruir una imagen tridimensional. Además, se pueden utilizar distintas longitudes de onda para excitar la fluorescencia de diversas moléculas. Como existen sondas fluorescentes características de numerosos orgánulos y estructuras celulares, se pueden obtener con facilidad imágenes específicas de núcleos, mitocondrias, fibras de actina, etc.
Fluorescencia multifotónica.
Esta técnica constituye otro procedimiento para eliminar la luz no enfocada, aunque se basa en un fenómeno enteramente distinto, como es la absorción de varios fotones —habitualmente dos— en un único suceso cuántico. En la microscopía confocal, la luz no enfocada se elimina a través del agujero estenopeico (pinhole) pero todo el espesor de la muestra es iluminado, con los consiguientes riesgos ciertos de fotoblanqueamiento y fototoxicidad. En cambio, en la microscopía multifotónica sólo se ilumina la muestra en el propio plano focal.
En el caso más frecuente de la microscopía de dos fotones, la excitación se produce por la absorción simultánea de dos cuantos de luz. Como la energía de un fotón es inversamente proporcional a su longitud de onda, los dos fotones absorbidos deben tener una longitud de onda doble de la requerida para la excitación por un fotón único. Por ejemplo, una molécula fluorescente que absorbe normalmente luz ultravioleta de 350 nm puede también ser excitada por dos fotones de luz infrarroja de 700 nm que actúen simultáneamente (en unos 10-18s).
Como la fluorescencia de dos fotones depende de la doble absorción simultánea, la emisión fluorescente depende del cuadrado de la intensidad de la excitación. Para obtener un número significativo de sucesos de doble excitación, la densidad de fotones debe ser un millón de veces superior a la necesaria para excitar con un fotón. Esto se consigue sin dificultad utilizando láseres pulsados (mode-locked) en los cuales la intensidad en el máximo del pulso es suficiente para generar excitación por dos fotones, al tiempo que la intensidad media de la irradiación láser no es demasiado alta. Esto permite obtener, con dos fotones, la misma intensidad de emisión fluorescente que con fotón único.
Cuando el láser se enfoca en un punto de la muestra, allí, y sólo allí, se produce una concentración de fotones suficiente como para generar la doble excitación. El enfoque óptimo concentra los fotones en el espacio y el pulso de láser los concentra en el tiempo, de modo que sólo una pequeña fracción de la muestra y sólo durante un corto espacio de tiempo están afectados por la radiación. En consecuencia, la microscopía de dos fotones consigue una resolución tridimensional idéntica a la obtenida en un microscopio confocal ideal. Además, como no hay absorción en las regiones no enfocadas, la penetración de la luz en la muestra es dos o tres veces mayor que la alcanzable con la microscopía confocal. Por otra parte, la baja energía media que recibe la muestra la protege del fotoblanqueamiento y la fotolisis.
La proteína verde fluorescente.
Junto a estos avances físicos y tecnológicos, es necesario mencionar aquí un descubrimiento biológico de similar importancia en las tecnologías de imagen. Se trata de la llamada proteína verde fluorescente (green fluorescent protein, GFP) y sus derivados. La GFP fue aislada de una medusa, Aequorea victoria, y rápidamente clonada, de manera que está disponible en cantidades ilimitadas. Como su propio nombre indica, es una proteína que emite espontáneamente una fluorescencia verde intensa. La proteína es muy robusta y se puede unir, químicamente o por ingeniería genética, a casi cualquier otra proteína. La proteína quimérica resultante tiene normalmente la fluorescencia verde de uno de sus integrantes, mientras mantiene las funciones y la localización celular del otro. Así, la GFP se ha convertido en una herramienta utilísima para estudiar la localización, la dinámica y las interacciones de las proteínas en las células.
Más recientemente se aisló de la anémona marina Discosoma striata una proteína fluorescente roja (RFP) con aplicaciones parecidas a la GFP. A partir de éstas, por modificaciones genéticas, se ha conseguido un número de proteínas fluorescentes —en la actualidad una treintena— que cubren todo el espectro visible.
Recuperación de la fluorescencia tras el fotoblanqueado.
El nombre original de esta técnica es fluorescence recovery after phobleaching (FRAP). Es una técnica conocida desde hace varias décadas, pero que ha visto su utilidad grandemente aumentada con los desarrollos físicos y biológicos que acabamos de mencionar. En este procedimiento se distinguen dos etapas: (a) las moléculas fluorescentes de una pequeña región de la célula se fotoblanquean con un láser de alta potencia, y (b) se observa la recuperación de la fluorescencia en la zona dañada, a medida que se van difundiendo a esa región moléculas fluorescentes que se encontraban originalmente fuera de ella (Fig. 10). Las moléculas de proteína fluorescente verde GFP son ideales para el FRAP porque pueden fotoblanquearse en condiciones poco lesivas para la célula.
Los experimentos de FRAP permiten obtener dos parámetros principales: la fracción móvil (Mf) o fracción de proteínas fluorescentes que se pueden difundir a la zona blanqueada durante el tiempo que dura el experimento, y la constante de difusión (D), que es una medida de la movilidad de una proteína en ausencia de flujo dirigido o transporte activo. D refleja el desplazamiento cuadrático medio de una proteína en movimiento al azar, y tiene unidades de superficie x tiempo-1 —por ejemplo, μm2/s—. Las medidas experimentales de D obtenidas por FRAP dan valores desde 87 μm2/s para la GFP pura en agua hasta 0,03 μm2/s para la E-cadherina unida a GFP. La E-cadherina es una proteína de la membrana plasmática anclada al citoesqueleto, y por ello casi inmóvil. La GFP en el citoplasma tiene una constante de difusión de 25 μm2/s, y las proteínas de membrana —unidas a GFP— no ancladas al citoesqueleto tienen típicamente valores de D ≈0,3-0,6 μm2/s. La fracción móvil Mf refleja la facilidad con la que la proteína fluorescente puede moverse en el interior de la célula. Una Mf inferior al 100 % indica que parte de las moléculas fluorescentes pueden estar unidas irreversiblemente a un sustrato inmóvil. También puede tratarse de obstáculos a la difusión, o discontinuidades en la estructura a través de la cual se difunden las proteínas.
Imágenes a partir de tiempos de vida de fluorescencia.
Otra técnica importante es la que se abrevia como FLIM (fluorescente lifetime imaging microscopy). Esta técnica consiste en elaborar mapas de la distribución espacial de tiempos de vida dentro de una célula o una parte de ella. El tiempo de vida es una característica propia de la molécula fluorescente, y es del orden de nanosegundos. Se define en relación con la caída exponencial de la emisión después de que una molécula fluorescente haya sido excitada. En otras palabras, el tiempo de vida es el tiempo medio que dura el estado excitado de las moléculas fluorescentes.
El tiempo de vida no varía con la intensidad de la fluorescencia, ni con la concentración de fluoróforo, ni con las características ópticas del microscopio. En cambio, se dan casos en los que las moléculas fluorescentes interaccionan con otras, fluorescentes o no, de modo que el rendimiento cuántico de las primeras disminuye. Algunas moléculas de interés biológico que modifican con frecuencia los tiempos de vida de la fluorescencia son el oxígeno, el ión calcio, y los hidrogeniones. En estos casos los fluoróforos pierden la energía de su estado excitado mucho más rápidamente y, por ello, su tiempo de vida se acorta. El FLIM mide estos cambios en los tiempos de vida y, por lo tanto, se utiliza para detectar interacciones moleculares e, indirectamente, cambios en las concentraciones de biomoléculas.
El FLIM se puede observar de dos maneras: en dominio de tiempos y en dominio de frecuencias. El primero es el más utilizado en microscopía confocal. Se utiliza un pulso de láser con una duración de unos pocos cientos de picosegundos y un obturador a escala de nanosegundos, ya que el tiempo de vida de un estado excitado es habitualmente de unos 10-20 ns. El tiempo de vida se mide así en cada píxel o elemento de imagen, y los mapas de tiempos de vida (imágenes FLIM) se muestran en pseudocolor. Así se consiguen, por ejemplo, mapas de la distribución de iones calcio o de pH, en una célula o en un tejido, con la consecuente posible aplicación clínica.
Otra importante aplicación del FLIM es la observación de la transferencia de energía por resonancia. Este fenómeno, habitualmente conocido como FRET (fluorescence resonance energy transfer) se basa en un fenómeno conocido desde hace un siglo, pero que también ha adquirido un nuevo interés por la combinación de avances tecnológicos y físicos. El FRET se basa en el caso de dos moléculas fluorescentes tales que: (a) el espectro de emisión de una de ellas (donante) se superponga con el espectro de excitación de la otra (receptora), y (b) se hallen ambas muy próximas —en la práctica, a menos de 10 nm—. Cuando esto ocurre, si excitamos la fluorescencia de la molécula donante D su emisión servirá para excitar la molécula receptora R, que a su vez emitirá su fluorescencia característica. En resumen, excitando la fluorescencia de D observaremos la emisión fluorescente de R.
Aunque el FRET se puede medir, por ejemplo, a través del aparente blanqueamiento, o pérdida de fluorescencia, del donante D, es mucho mejor medirlo por FLIM. Las medidas de FRET por FLIM son mucho más fiables y cuantitativas, y, como hemos dicho más arriba, son independientes de la intensidad de la emisión fluorescente. Además, por FLIM basta con medir el tiempo de vida del donante, de modo que no importa si el receptor tiene una emisión ineficiente —la segunda molécula puede incluso ser no fluorescente, como el oxígeno.
Espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS).
Esta es una técnica muy sensible utilizada para detectar interacciones moleculares. La FCS registra los movimientos al azar de moléculas fluorescentes en un elemento de volumen irradiado por un láser enfocado. Los movimientos de las moléculas dan lugar a fluctuaciones medibles en la señal fluorescente. Estas fluctuaciones dan información sobre la difusión de una partícula y ésta, a su vez, depende de la masa de la partícula. Por consiguiente, cualquier aumento en la masa de una biomolécula, por ejemplo, como resultado de la interacción con una segunda molécula, se detecta fácilmente como un aumento en el tiempo de difusión. Utilizando la óptica confocal se selecciona un volumen muy pequeño, en el que el número de moléculas fluorescentes es necesariamente reducido. Este volumen puede ser parte de una disolución, o parte del citoplasma de una célula.
Aunque la trayectoria de difusión de una molécula a través del punto focal se produce al azar, se pueden calcular los tiempos medios de difusión y, por tanto, las masas moleculares, a partir de la correlación temporal de la señal de muchas moléculas individuales. Esta técnica se ha utilizado, por ejemplo, para observar la agregación de unidades de prión que se produce en distintos procesos patológicos de origen priónico.
El futuro que viene: la nanoscopía.
Se sabe desde Abbe (1873) que la resolución de un microscopio óptico está limitada por la difracción. Incluso utilizando microscopios confocales o multifotónicos, la resolución no es mejor que 180 nm en el plano focal, y 500 nm a lo largo del eje óptico. Sin embargo, están empezando a aparecer propuestas que parecen superar la barrera de la difracción. Stefan W. Hell ha diseñado el microscopio STED (stimulated emisión depletion), basado en la depleción del estado molecular fluorescente por estímulo de la emisión (Fig. 14). Al vaciarse un estado molecular que es esencial para el proceso de fluorescencia, se elimina el efecto de la difracción sin eliminar la difracción. El STED ha conseguido una resolución lateral de 28 nm en experimentos con moléculas aisladas, y sus autores consideran que el resultado es mejorable. En la actualidad Hell y su equipo trabajan para conseguir resoluciones laterales del orden de 10 nm utilizando una proteína púrpura fluorescente expresada en células vivas.
Félix M. Goñi es director de la Unidad de Biofísica (UPV/EHU-CSIC)