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versión On-line ISSN 2007-8080versión impresa ISSN 0185-3309
Rev. mex. fitopatol vol.31 no.1 Texcoco 2013
Atrículos de revisión
La Biosíntesis de las Poliaminas en el Hongo Fitopatógeno Macrophomina phaseolina
Polyamine Biosynthesis in the Phytopathogenic Fungus Macrophomina phaseolina
Martha Viviana Roa Cordero y Raymundo Rosas Quijano
Centro de Biotecnología Genómica (CBG) del Instituto Politécnico Nacional (IPN). Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Reynosa, Tamaulipas, CP 88710, México. Correspondencia: email@example.com
Recibido: Diciembre 12, 2012
Aceptado: Abril 08, 2013
Resumen
El estudio del mecanismo biosintético de las poliaminas en los hongos fitopatógenos permite precisar las particularidades metabólicas de este proceso biológico, que pese a su conservación evolutiva, facilita la comprensión del papel que desempeñan estos compuestos en el proceso patogénico. Macrophomina phaseolina es un hongo fitopatógeno con un amplio espectro de hospedantes que incluye diferentes especies de granos de interés agroeconómico, tales como legumbres y vegetales. Debido a su potencial necrotrófico, elevada persistencia y distribución geográfica globalizada, la comprensión del papel regulador que ejercen las poliaminas en la virulencia de este microorganismo, constituye un eslabón fundamental para el entendimiento del patosistema planta-M. phaseolina. Mientras se progresa en la descripción de la ruta biosintética de las poliaminas en este fitopatógeno, nosotros discutimos un modelo sobre la síntesis de estos compuestos y su función en la patogénesis, basados en la evidencia de su genoma, recientemente secuenciado.
Palabras clave: Ornitina, putrescina, espermidina, espermina, pudrición carbonosa, antienzima.
Abstract
The study of polyamine biosynthetic mechanisms in phytopathogenic fungi is relevant in order to clarify the metabolic variations of this biological process, which despite its evolutionary conservation, could help to understand the role of these compounds in the fungal pathogenic process. Macrophomina phaseolina is a fungal plant pathogen with wide host spectrum including economically important crops such as legumes and vegetables. Due to its necrotrophic potential, high persistence and global distribution, the comprehension of the regulatory role played by polyamines in fungal virulence is a key factor to understand the pathosystem plant-M. phaseolina. Since polyamine metabolism in M. phaseolina is not yet completely understood, we discuss a model to explain the polyamine biosynthetic pathways and their role in the pathogenesis, based on their recently sequenced genome.
Keywords: Ornithine, putrescine, spermidine, spermine, charcoal rot, antizyme.
Las características generales de los organismos obedecen al binomio herencia-ambiente, lo que establece una estrecha relación entre los rasgos genéticos de los individuos y sus respuestas a las diferentes condiciones del entorno. Esto podría explicar la evolución de sistemas de regulación complejos que permiten la adaptación celular y reflejan la interacción hospedero-patógeno.
Las poliaminas son policationes alifáticos de origen orgánico, que gracias a su versatilidad y ubicuidad participan en la regulación de procesos moleculares y celulares. Se trata de compuestos nitrogenados cuya carga positiva, distribuida a lo largo de la molécula, los capacita para establecer asociaciones con proteínas, ácidos nucleicos y membranas celulares. Se ha descrito además que, dada su alta concentración en el citoplasma, pueden comportarse como osmolitos (Rajam et al., 2004). La diamina putrescina, la triamina espermidina y la tetramina espermina son las poliaminas más abundantes en las células vivas (Groopa y Benavides, 2008); no obstante, pese a que la espermina se encuentra en la mayoría de eucariotas superiores, un gran número de especies fúngicas no la sintetizan (Morgan, 1998; Valdés-Santiago et al., 2012).
El estudio de las poliaminas en diferentes modelos (mamíferos, parásitos protozoarios, hongos, plantas, etc.) ha permitido dilucidar su papel como reguladores de una amplia gama de procesos biológicos relacionados con el crecimiento, desarrollo y la diferenciación celular, entre otros (Coburn, 2009; Igarashia and Kashiwagic, 2010; Iacomino et al., 2012). Inicialmente se les atribuyó este papel únicamente sobre la base de evidencia circunstancial, que reveló un incremento en la concentración de poliaminas en tejidos altamente proliferativos, así como también un aumento precipitado de la actividad enzimática mediadora de su biosíntesis, cuando el crecimiento o la diferenciación celular fueron inducidos (Heby, 1981; Tabor y Tabor, 1985; Kaur-Sawhney et al., 1988; Desforges et al., 2013). Investigaciones posteriores confirmaron su papel como reguladores de la embriogénesis somática, desarrollo de flores y frutos, respuesta al estrés biótico y abiótico, senescencia, formación de la raíz y brotes en vegetales (Rajam et al., 2004; Wimalasekera et al., 2011; Tisi et al., 2011) ; la función de las poliaminas en células de mamíferos resulta mucho más compleja, ya que participan en la regulación de diversas actividades celulares a nivel transcripcional, traduccional y post-traduccional, afectando procesos de proliferación, transformación, diferenciación y de apoptosis (Chattopadhyay et al., 2008). Así mismo, se ha establecido que las poliaminas regulan de cierto modo la virulencia de los hongos fitopatógenos, dada la estrecha relación que existe entre su metabolismo y fenómenos biológicos como el dimorfismo, la germinación de esporas, la formación de apresorio y la conidiación (Guevara-Olvera et al., 1993; Khurana et al., 1996; Valdés-Santiago et al., 2012).
A pesar de las particularidades funcionales y del metabolismo de las poliaminas en las células eucariotas y procariotas, su papel en la regulación de diferentes procesos biológicos está determinado principalmente por su naturaleza catiónica, que les permite interactuar con los ácidos nucleicos, fosfolípidos de membrana y algunos componentes de la pared celular. Como consecuencia de estas interacciones, las poliaminas estabilizan la estructura de las macromoléculas polianiónicas, afectan la expresión de los genes y de diversas enzimas (incluidas cinasas y fosfatasas), influyen selectivamente en la traducción de algunos mRNA, regulan interacciones DNA-proteína y el proceso de apoptosis (Chattopadhyay et al., 2008; Pegg, 2009; Valdés-Santiago et al., 2012).
Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid, el agente etiológico de la pudrición carbonosa, es un hongo fitopatógeno de gran importancia económica debido a su amplio espectro de hospederos, en el que figuran más de 500 especies de plantas que incluyen granos de consumo masivo como frijol, sorgo, algodón y maíz, entre otros (Jana et al., 2003). Esta enfermedad afecta a plantas de toda América, Asia, África y algunos países de Europa, teniendo especial predilección por aquellas regiones tropicales y subtropicales de áridas a semi-áridas (Islam et al., 2012).
Dentro de los mecanismos de virulencia documentados se incluyen la síntesis de toxinas, endoglucanasas, producción de picnidios y esclerocios, cuya biogénesis es estimulada bajo condiciones de estrés oxidativo e hídrico, garantizando de esta forma la sobrevivencia del patógeno en el suelo por largos periodos de tiempo (Short et al., 1980; Gray et al., 1991; Baird et al., 2003; Kaur et al., 2012). La secuenciación del genoma de M. phaseolina, por su parte, pone en evidencia otros elementos que participan en la patogénesis, tales como enzimas hidrolíticas de carbohidratos y de ligninocelulosa; genes de virulencia implicados en procesos de adhesión, biosíntesis de purinas y micotoxinas; genes implicados con procesos de desintoxicación celular y codificadores de transportadores de aminoácidos y poliaminas, entre otros (Islam et al., 2012). No obstante, pese a la reciente accesibilidad al genoma, la base molecular del proceso fisiopatogénico de este polífago solo se comprende parcialmente, por lo que resulta de interés investigar el papel que desempeñan las poliaminas en la regulación de la virulencia de M. phaseolina y su función en el patosistema, teniendo en cuenta la evidencia experimental de su importancia en la interacción planta-microorganismo establecida por otros fitopatógenos. La presente revisión propone un modelo para describir la ruta biosintética de poliaminas en M. phaseolina, basado en la secuencia de su genoma, recientemente liberada.
Mecanismos de Biosíntesis y Regulación de las Poliaminas. El mecanismo de biosíntesis de las poliaminas es común en todos los organismos, salvo por algunas particularidades que detallaremos en el presente apartado. La síntesis de poliaminas comienza con la descarboxilación de la ornitina para formar putrescina, en una reacción catalizada por la ornitina descarboxilasa (EC 184.108.40.206), que constituye el paso limitante del metabolismo de estos compuestos. La ornitina puede derivarse del ciclo de la urea, o de la hidrólisis de la arginina por acción de la arginasa (EC 220.127.116.11). La síntesis de la putrescina puede lograrse además, a través de la descarboxilación de la arginina por la enzima arginina descarboxilasa (EC 18.104.22.168), tal como sucede en bacterias y plantas superiores. Se ha sugerido que la síntesis de putrescina en hongos está determinada principalmente por la actividad de la ornitina descarboxilasa y que al igual que en células de mamíferos, ésta es la única vía de biosíntesis de putrescina (Morgan, 1998; Coffino, 2001; Bagni y Tassoni, 2001; Valdés-Santiago et al., 2012). No obstante, existen reportes que demuestran la actividad de arginina descarboxilasa en una variedad de hongos incluidos fitopatógenos, cuyo crecimiento es inhibido al entrar en contacto con inhibidores de arginina descarboxilasa y de ornitina descarboxilasa (Khan y Minocha, 1989; Gamarnik et al., 1994; Sannazzaro et al., 2004). Lo anterior evidencía que en algunos de estos microorganismos, como en las plantas superiores, las dos rutas metabólicas pueden ser funcionales. Los organismos que poseen una ruta constitutiva para sintetizar putrescina vía agmatina, poseen actividad enzimática arginina descarboxilasa y agmatinasa (EC 3 5.3.11) para formar putrescina con eliminación de urea. Algunas plantas poseen rutas alternativas para catalizar la síntesis de putrescina vía agmatina, involucrando dos pasos importantes: transformación de agmatina a N-carbamoilputrescina, por acción de la enzima agmatina iminohidrolasa (EC 22.214.171.124) y formación de putrescina a partir de este intermediario, por acción de N-carbamoilputrescina amidohidrolasa (EC 126.96.36.199).
La síntesis de las poliaminas espermidina y espermina se logra por adición de grupos aminopropil a los precursores putrescina y espermidina, en reacciones catalizadas por espermidina sintasa (EC 188.8.131.52) y espermina sintasa (EC 184.108.40.206), respectivamente. Los grupos aminopropil son derivados del compuesto S-adenosilmetionina descarboxilado, que es sintetizado a partir de la descarboxilación de S-adenosilmetionina por S-adenosilmentionina descarboxilasa (EC 220.127.116.11). Como ya se mencionó en otro apartado, la síntesis de espermina es característica de los sistemas eucarióticos, sin embargo, no todos los hongos poseen la maquinaria enzimática necesaria para sintetizar este compuesto (Nickerson et al., 1977).
El proceso biosintético puede revertirse por una serie de reacciones catabólicas que están diseñadas para proporcionar las poliaminas requeridas rápidamente. Este ciclo de interconversión consiste en reacciones de acetilación catalizadas por espermidina/espermina acetiltransferasa (EC 18.104.22.168) y escisión oxidativa subsecuente, por la enzima dependiente de FAD (flavina adenina dinucleótido), poliamina oxidasa (EC 22.214.171.124). La ruta de biosíntesis de poliaminas es esquematizada en la Figura 1.
La regulación de los niveles de poliaminas constituye un mecanismo esencial para la adecuada supervivencia de la célula, ya que estados carenciales o de síntesis ilimitada pueden generar consecuencias deletéreas (Poulin et al., 1993).Tal proceso se determina principalmente por la actividad de las enzimas ornitina descarboxilasa, S-adenosilmetionina descarboxilasa (ODC y SAMDC, respectivamente) y por la espermina/espermidina acetiltransferasa. Es evidente además, que las poliaminas ejercen un mecanismo de control biosintético por hidrólisis independiente de ubiquitinación, que es gobernado por una proteína inhibidora, denominada antienzima (Az) de la ODC (Heller et al., 1976). La Az actúa como un sensor de poliaminas y se sintetiza a partir de dos marcos de lectura abiertos (ORFs) sobrepuestos, a través de un cambio de fase +1 en el marco de lectura abierto +1 frameshifting a nivel ribosomal, estimulado por las poliaminas, en un mecanismo inusual de inactivación y reconocimiento de la ODC, para su posterior hidrólisis por el proteasoma 26S (Chattopadhyay et al., 2011). La Az genera una disrupción en la actividad de los homodímeros de ODC al unirse al sitio catalítico para constituir un heterodímero afuncional (ODC-Az). La formación de este complejo conduce a la exposición del dominio carboxi-terminal de ODC, haciéndolo accesible para reconocimiento por el proteasoma; evento que, sumado a la inhibición estequiométrica, disminuye el tiempo de vida media de la enzima y favorece su hidrólisis. La eficiencia de esta proteólisis está mediada por un dominio que reside en la región N-terminal de la Az. Una vez el proteasoma procesa el complejo ODC-Az, se prosigue con la hidrólisis de ODC y subsecuente liberación de la Az, para dar continuidad al proceso regulador (Coffino, P., 2001). La actividad inhibitoria de la Az también se lleva a cabo por modulación del transporte de poliaminas y puede ser desregulada por una proteína inhibitoria de la antienzima (AZI), a través de un mecanismo de hidrólisis dependiente de ubiquitinación, que a su vez, es regulado negativamente por las poliaminas (Palanimurugan et al., 2004).
El cambio en el marco de lectura traduccional es el sensor y efector del circuito regulador de transporte y biosíntesis de poliaminas, que ha sido identificado en mamíferos, protistas y hongos, sugiriendo que su distribución obedece a la presencia de este mecanismo en el último ancestro común de las especies de tres de los cuatro reinos eucariotas (Ivanov y Atkins, 2007). En hongos, los genes de la Az se encuentran en al menos cuatro diferentes filos, a saber: Ascomycota, Basidiomycota, Glomeromycota y Zygomycota; aunque la mayoría de ejemplos corresponden a especies del filo Ascomycota (Ivanov y Atkins, 2007), donde se ubica taxonómicamente M. phaseolina.
La presencia de genes ortólogos de la Az ha sido reportada en levaduras como Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae, modelos en los que la sobre-expresión génica (SPA y OAZ1, respectivamente) inhibió la división celular (Ivanov et al., 2000b; Palanimurugan et al., 2004). En el caso particular de S. pombe, la deleción del gen SPA no produjo efectos detectables sobre la viabilidad de las levaduras o cualquier otro cambio fenotípico manifiesto, salvo la acumulación de poliaminas, que durante la fase estacionaria alcanzó concentraciones 20 veces superiores a las obtenidas en la de crecimiento exponencial, en comparación con las cepas nativas. De acuerdo a lo anterior, se pudo establecer que SPA es el regulador principal de la ODC en este microorganismo y que puede tener actividad a corto y largo plazo (Ivanov et al., 2000b).
Existen cerca de 70 genes que codifican la Az en especies fúngicas, identificados in silico (Ivanov y Atkins, 2007). Se conocen las secuencias de Pneumocystsis carinii, Botryotinia fuckeliana, Emericella nidulans, Schizosaccharomyces japonicum y Schizosaccharomyces octosporus (Ivanov et al., 2000a). Así mismo, se ha progresado en la identificación de secuencias homólogas de 11 levaduras relacionadas con la Az de Saccharomyces cerevisiae (Ivanov et al., 2006).
Papel de las Poliaminas en el Proceso Patogénico de los Hongos Fitopatógenos. Aunque el papel de las poliaminas en los patosistemas no es comprendido del todo, existe evidencia que revela su paradójico papel en la interacción planta-hongo, ya que actúan como moduladores del proceso invasivo del patógeno; y a su vez, del mecanismo defensivo de la planta (Chibucos y Morris, 2006). Constituyen por lo tanto, un sistema finamente regulado cuya disrupción se perfila como una alternativa ideal para el desarrollo de técnicas de control de fitopatógenos. No obstante, deben investigarse las respuestas particulares de los microorganismos, ya que los resultados experimentales existentes ponen de manifiesto por una parte, la actividad de las poliaminas como promotores de eventos involucrados en la colonización del hospedero, tales como germinación de semillas, crecimiento micelial, desarrollo de apresorios y esclerocios (Pieckenstain et al., 2001; Rajam et al., 1986; Reitz, 1995) y por otra parte, su efecto inhibitorio asociado a interacciones con las cascadas de señalización dependientes de calmodulina/calcineurina y AMP cíclico, importantes para la morfogénesis, adaptación y virulencia (Choi et al., 1998; Ahn et al., 2003).
Los Modelos Moleculares del Proceso Patogénico en Macrophomina phaseolina. El ciclo infectivo de M. phaseolina comienza con la diseminación del esclerocio, fuente primaria de inoculación de elevada persistencia que se encuentra en las raíces y tejidos de hospederos colonizados; suelo y detritus provenientes de tejidos vegetales en descomposición. La severidad de la pudrición carbonosa demuestra una correlación directa con la densidad poblacional de esclerocios presentes en el suelo, que a su vez se ve afectada por temperaturas extremas (50 °C y -10 °C) (Short et al., 1980). También se ha documentado que la presencia de residuos de soja en la superficie del suelo favorece la supervivencia de M. phaseolina durante el invierno, así como la diversidad de hongos patógenos y saprófitos que pueden modular negativamente su persistencia (Baird et al., 2003). La formación del microesclerocio es un evento de diferenciación de gran importancia para la supervivencia de los hongos filamentosos, cuyo desarrollo es inducido, entre otros, por estrés oxidativo (Georgiou et al., 2006). La teoría general de diferenciación de los microorganismos eucariotas postula que este fenómeno es activado por estados hiperoxidantes, esto es, estados en los que la concentración de radicales libres de oxígeno en el interior celular, superan su capacidad para neutralizarlos. De acuerdo a este postulado, el estrés oxidativo media la transición de estados indiferenciados a estados diferenciados, con tres posibles respuestas: 1) adaptación celular mediada por sustancias reductoras que neutralizan las especies reactivas de oxígeno (ROS), con subsecuente retorno al estadio original; 2) la célula alcanza un estado de diferenciación más estable, limitando la entrada de oxígeno ambiental y 3) muerte celular por incapacidad para reducir o limitar la entrada de oxígeno. Los estados indiferenciados y aquéllos diferenciados corresponden a estados de estabilidad celular, que en el caso del esclerocio, son resultado del aislamiento autónomo del oxígeno ambiental, a través de la generación de estructuras impermeables al oxígeno (Georgiou et al., 2006). Otros autores han demostrado la estrecha relación entre el estrés oxidativo y la diferenciación esclerótica de hongos como Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium rolfsii y Sclerotinia minor (Patsoukis y Georgiou, 2007; Papapostolou y Georgiou, 2010). Diferentes estudios han revelado el papel de las poliaminas como agentes protectores frente al estrés oxidativo (Gropa et al., 2001; Fujisawa et al., 2005; Chattopadhyay et al., 2006), demostrando la correlación directa que existe entre el número de grupos amino de sus moléculas y su poder antioxidante (Lovaas, 1991). Shapira et al. en 1989, describieron que durante la formación del esclerocio de Sclerotium rolfsii, el nivel de poliaminas endógenas disminuye; pero incrementa durante la germinación del esclerocio y el crecimiento micelial.
Basados en estas observaciones, proponemos que las poliaminas pueden ejercer un efecto modulador del proceso patogénico de M. phaseolina, por medio de la regulación de la esclerogénesis, que puede ser inhibida gracias a su actividad como secuestradores de radicales libres y a su capacidad para neutralizar los procesos de peroxidación lipídica. No obstante, es claro que una vez se alcanzan los diferentes estadios de maduración del esclerocio, estos metabolitos pueden participar en la estabilización de los estados diferenciados y estimular su germinación, que resulta en el crecimiento de la hifa en dirección a la superficie hospedadora, antes de la penetración (Dhingra y Sinclair, 1978).
La formación de apresorio es otra de las características del proceso infectivo de M. phaseolina (Ammon et al., 1975). Su desarrollo deriva de la formación del tubo germinal y favorece la adherencia e invasión del hospedador a través de su epidermis, coadyuvado por enzimas que hidrolizan la pared celular y a su vez, favorecen el proceso invasivo (Mayek-Pérez et al., 2002). La entrada del fitopatógeno también puede estar mediada por lesiones del tejido vegetal que constituyen otra puerta de entrada para el microorganismo (Kaur et al., 2012). La participación de las poliaminas en la regulación del desarrollo del apresorio ha sido estudiada en hongos como Magnaporthe grisae y Uromyces viciae-fabae. Se encontró que el uso de inhibidores de ODC, SAMDC y espermidina sintasa, reduce parcial o completamente la formación del apresorio por uredosporas de Uromyces viciae-fabae, haciendo uso de concentraciones tan bajas como 0.025 mM del inhibidor de SAMDC; en general, la reducción de la formación del apresorio a las diferentes concentraciones evaluadas, osciló entre 63-100 % y no se obtuvo efecto alguno sobre la germinación de las conidias (Reitz et al., 1995). En el caso de Magnaporthe grisae, se evaluó el efecto de la adición de putrescina, espermina y espermidina a nivel exógeno, sobre una suspensión de conidias; el experimento puso en evidencia la capacidad de las poliaminas para reducir el AMP cíclico, importante modulador de la formación del apresorio en este fitopatógeno, con la subsecuente inhibición de esta estructura; efecto que se revirtió al adicionar el AMPc (Choi et al., 1998).
La diferenciación y maduración del apresorio son eventos críticos en el desarrollo de la infección, por lo que resulta de interés abordar un diseño experimental que permita evaluar el papel que desempeñan las poliaminas en la formación del apresorio, en M. phaseolina.
Una vez el patógeno ha penetrado la pared celular epidérmica, la colonización del tejido vascular que resulta del crecimiento intracelular de las hifas, constituye la siguiente etapa del proceso patogénico. El crecimiento del micelio es un evento relacionado con los niveles endógenos de poliaminas. Estudios en Glomus mosseae sugieren que la elevada concentración de poliaminas exógenas (10 mM) puede ser un factor limitante del crecimiento, o ejercer efectos estimulantes a bajas concentraciones (1mM). Niveles elevados de poliaminas también pueden generar toxicidad en plantas, como resultado de la alteración de diferentes efectos fisiológicos por acumulación de poliaminas, dentro de los que se cuentan la despolarización de la membrana celular, que aumenta la fuga de cationes (K+, Mg2+), o la acumulación de los productos de la oxidación de las poliaminas, peróxido de hidrógeno y radicales libres, que pueden tener efectos deletéreos sobre el microorganismo (El Ghachtouli et al., 1996). Otros estudios han revelado el papel de la putrescina en el crecimiento del micelio de Aspergillus flavus (Khurana et al, 1996) y en la transición dimórfica de Yarrowia lipolytica (Jiménez-Bremont et al., 2001).
La función de las poliaminas también ha sido estudiada en otros eventos morfogenéticos de los hongos, que ponen de manifiesto la actividad biosintética de estos policationes durante la elongación del tubo germinal y la germinación de esporas; se ha reportado que para el desarrollo de estos procesos, Aspergillus flavus requiere una alta tasa de putrescina/espermidina, mientras que la diferenciación de esporas bajo el microciclo de conidiación se favorece con una baja tasa de putrescina/espermidina; esto revela el papel que ejerce la espermidina en los procesos de diferenciación celular y desarrollo de las conidias bajo el microciclo de conidiación, característico de hongos de este género (Khurana et al., 1996). Aunque no existen reporte sobre la inducción del microciclo de conidiación en M. phaseolina, las implicaciones de las poliaminas en la diferenciación celular y esporogénesis son de trascendental interés para avanzar en el conocimiento de los mecanismos de regulación del proceso de invasión y colonización de este patógeno.
La producción de fitotoxinas en M. phaseolina, al igual que sucede con otros fitopatógenos, favorece el proceso de colonización del hospedero; sin embargo, su papel en el desarrollo de la enfermedad no ha sido comprendido del todo. La secuencia del genoma de este microorganismo confirma la existencia de sintetasas peptídicas no ribosomales, que catalizan la producción de péptidos cíclicos en donde se incluyen numerosas micotoxinas (Islam et al., 2012). Estudios con un inhibidor de la ODC y cepas no esporogénicas de Aspergillus parasiticus han permitido demostrar la correlación existente entre la regulación de la producción de aflatoxinas y el proceso de esporulación (Guzmán-de-Peña y Ruiz-Herrera, 1997), que está modulado a su vez, por el metabolismo de las poliaminas. El conocimiento de los mecanismos de regulación de la síntesis de toxinas en M. phaseolina, dada su estrecha relación con los mecanismos de regulación de la síntesis de pigmentos de las esporas de otros hongos, permitirá comprender las implicaciones que tienen en el proceso patogénico y dilucidar a detalle su papel como mecanismos de patogenicidad y virulencia en aislamientos particulares.
Ruta Metabólica de Poliaminas en Macrophomina phaseolina. La ruta metabólica de poliaminas que poponemos como modelo en M. phaseolina (Figura 2) fue construida por medio de un análisis BLAST, usando proteínas de referencia de Magnapothe oryzae, por tratarse del fitopatógeno que presenta la menor distancia filogenéticatica (Crous et al., 2006) con información disponible en la base de datos del NCBI. En los casos en los que no fue posible hacer el análisis con este microorganismo, se utilizaron hongos del género Aspergillus, Laccaria y Verticillium. La Tabla 1 muestra los números de acceso y porcentajes de identidad obtenidos para aquéllas proteínas de la ruta metabólica que no se encuentran anotadas en el genoma de M. phaseolina.
De acuerdo a los hallazgos del análisis in silico es posible afirmar que M. phaseolina cuenta con la maquinaria enzimática para sintetizar espermina, a diferencia de lo reportado por Nickerson et al. en 1977. Nuestros hallazgos son cosistentes con las observaciones de otros autores que atribuyen la ausencia de niveles detectables de espermina en los hongos filamentosos evaluados, a las desfavorables condiciones de regulación fisiológica bajo las cuales se produjo esta poliamina (temperatura, concentración de magnesio o manganeso, etc.) (Marshall et al., 1979). La producción de espermina por M. phaseolina reviste particular interés, ya que se trata de un metabolito asociado a la función del esclerocio como estructura de resistencia y a la transición del micelio a esclerocio maduro en S. rolfsii (Shapira et al., 1989); así como a la maduración del esclerocio y crecimiento del micelio de Sclerotinia sclerotiorum (Gárriz et al., 2008). Se sabe además, que esta tetramina participa en diversas funciones celulares de los eucariotas que la sintetizan, tales como modulación o bloqueo de canales iónicos; regulación de la traducción; crecimiento celular en mamíferos (Stevens y Winther, 1979; Williams, 1997; Mandal et al., 2013) y que es requerida para la biosíntesis de β-alanina, un intermediario metabólico de la biosíntesis de Coenzima A, en levaduras (White et al., 2001).
Se encontró homología con todas las proteínas reguladoras de la ruta metabólica descritas para otros organismos, lo que garantiza la disponibilidad de las diferentes poliaminas según los requerimientos celulares de M. phaseolina. La presencia de la antienzima de ODC, constituye una evidencia adicional que reafirma la conservación evolutiva de este mecanismo, sin embargo es necesario demostrar experimentalmente sus particularidades, especialmente para dilucidar el mecanismo de control negativo de la antienzima, que aparentemente varía de hongo a hongo y difiere de los mecanismos de regulación de ODC, descritos para eucariotas superiores (Ivanov et al., 2000b).
Los resultados del análisis de homología no nos permiten confirmar la existencia de una ruta alternativa para síntesis de putrescina por actividad de arginina descarboxilasa (ADC), ya que el porcentaje de identidad obtenido al comparar la secuencia de esta enzima en Arabidopsis thaliana con aquélla de M. phaseolina (anotada en el genoma como Ornitina/DAP/Arginina descarboxilasa) fue solo de 24 % (valor E: 5e-04). No existen ADC fúngicas de referencia disponibles en el banco de datos, por lo que proponemos poner a prueba experimentalmente los efectos de la sobre expresión de la Az anotada en su genoma, para dilucidar si la descarboxilación de la ornitina es la única fuente de putrescina en M. phaseolina, tal como se ha demostrado en S. pombe (Ivanov et al., 2000b). Consideramos que el uso de inhibidores de la ODC como estrategia para evaluar actividad ADC en este hongo, no es la alternativa más adecuada, puesto que la insensibilidad a algunos inhibidores como difluorometilornitina (DFMO) ha sido reportada en Septoria tritici y Ustilago maydis (Smith et al., 1992; Walters, 1995).
PERSPECTIVAS Y CONCLUSIONES
La evaluación experimental de las características que ponemos en evidencia en el presente documento, así como la investigación detallada del genoma de M. phaseolina para encontrar otras, permitirán avanzar en la comprensión del metabolismo de las poliaminas en este patógeno y dilucidar su papel en los procesos de patogenicidad y virulencia, con miras a mejorar las estrategias de control del hongo desde la perspectiva integral del patosistema. Es necesario además, concentrar algunos esfuerzos para determinar la existencia de una ruta alternativa para la síntesis de putrescina vía agmatina, que nos permitan dilucidar si la actividad ADC está presente en este microorganismo y de ser así, explorar las condiciones de regulación genética bajo las cuales esta ruta podría ser activa.
AGRADECIMIENTOS. Este trabajo se desarrolló en las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología vegetal del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, bajo el financiamiento de los proyectos: SIP número 20120551 y CB-2011-01 169827. M.V. Roa-Cordero agradece a la Universidad de Santander (UDES), y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el apoyo para la realización de estudios de Maestría.
LITERATURA CITADA
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