Resumen: Los propóleos son sustancias resinosas complejas elaboradas por las abejas. Su composición química varía de acuerdo a la fuente vegetal. El estudio se realizó con muestras del noreste de Argentina. El objetivo del estudio fue comprobar el efecto fungicida y bactericida de soluciones etanólicas de propóleos procedentes de diferentes localidades de la provincia de Misiones sobre los fitopatógenos considerando la vegetación predominante en las áreas de origen sobre el índice de oxidación y el contenido de compuestos fenólicos. En las tres áreas estudiadas la vegetación ha sido modificada antrópicamente en forma diferente y los productos se correspondieron con las características de la flora introducida, compuesta por 7 especies vegetales diferentes en El Soberbio, 7 especies en El Dorado y 10 especies en Apóstoles. El índice de oxidación fue diferente en las tres áreas de estudio (7.37, 1.30 y 18.4), mientras el contenido de compuestos fenólicos no mostró diferencias significativas. Su actividad antimicrobiana a las concentraciones ensayadas (2, 4, 6, 8 y 10 %), no fueron efectivas en el control de cepas fúngicas probadas y si lo fueron sobre bacterias del género Bacillus.
Palabras clave:Propóleos, actividad antimicrobiana, control de fitopatógenos.
Abstract: The propolises are resinous complex sustances produced by bees. Their chemical composition is variable in according to the vegetal source. This study was realized with samples from northeast of Argentina. The aim of work were to check the fungicide and bactericide effects of etanolic solutions of propolis from different sites in Misiones province, on plant pathogens, considering the predominant vegetation in the original areas on the oxidation indexandfenolic compositions. As results in three studied areas the vegetation has been modified anthropically in different form, and the products are corresponding with the introduced flora characteristics, composed of 7 different plant species in El Soberbio, 7 species in El Dorado and 10 species in Apostoles. The physic and chemical proprieties and therapeutic action in propolis from the three collection areas in the Misiones province were similar. The oxidation rate was different in the three study areas (7.37, 1.30 y 18.4), while the phenolic content showed no significant difference. Their antimicrobial activity to probed concentrations (2, 4, 6, 8 y 10 %), don’t were effectives for control on the fungical strains but it is positive by the bacterial control of genus Bacillus.
Keywords: Propolis, antimicrobial activity, plant pathogens control.
ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN
Vegetación de origen como parámetro de caracterización microbiana de los propóleos
Origin vegetation as a parameter for characterization antimicrobial of propolis
Recepción: 01 Mayo 2014
Aprobación: 01 Abril 2016
Publicación: 01 Mayo 2016
El propóleo es un producto compuesto de sustancias resinosas, gomosas, balsámicas, ceras, aceites esenciales, polen y otros compuestos, de consistencia viscosa. Es elaborado por abejas fundamentalmente a partir de resinas de ciertas especies vegetales, que transportadas al interior de la colmena y modificadas parcialmente con sus secreciones salivares, con el fin de hermetizar y mantener la asepsia de la misma. (Salamanca-Grosso et al. 2006).
La abeja colecta resinas (componente principal) desde yemas, brotes y cortezas de distintas especies botánicas según sean sus necesidades. Luego de mezclarlas con polen, secreciones salivares, ceras y materiales provenientes del suelo, procede a la elaboración del producto final que es el propóleos (Salamanca-Grosso et al. 2006). Es por eso que la composición del propóleos varía de colmena a colmena y de región a región, e incluso de estación a estación, según la vegetación presente.
Se ha observado que la actividad biológica y terapéutica de los propóleos proviene de la presencia de flavonoides en su composición, la cual varía en función del origen geográfico (Noriega-Salmón 2014).
Si bien desde comienzos del siglo XX se realizaron estudios sobre la constitución del propóleos, en los años setenta se determinó que el propóleos tenía una estructura química compleja. Así, Tolosa & Cañizares (2002) obtuvieron y caracterizaron extractos etanólicos y acuosos de propóleos de diferentes localidades del estado de Campeche, México, probando posteriormente su efectividad antimicrobiana sobre bacterias patógenas de humanos. Ellos identificaron como metabolitos de los propóleos: lactonas, saponinas, fenoles, triterpenos, taninos, alcaloides, flavonoides, sustancias aminadas y leucoantocianidinas, estas últimas sólo en los extractos acuosos.
Posteriormente el análisis de numerosas muestras de regiones geográficas diferentes, condujo al descubrimiento de que su composición química, además de compleja, no era constante, sino variable, aduciendo que esta variabilidad está asociada fundamentalmente a la fuente vegetal (Nieva-Moreno et al. 1999, Park et al. 2004, Kumazawa et al. 2004, Banskova et al. 2001); pero a pesar de estas diferencias, este producto posee similares propiedades antifúngicas y antibacterianas (Peña 2008). Por ello el estudio de la vegetación circundante al apiario es importante y puede ser enfocado desde la perspectiva de los objetivos buscados. En el caso particular de la apicultura, la importancia de determinar lo que se podría llamar la "flora indicadora", radica en que no todas las especies vegetales presentes son de interés para la abeja cuando realiza la elaboración del propóleos, miel, etc. Es por eso que el aprovechamiento de una colmena está relacionado cualitativamente y cuantitativamente con la flora presente.
A pesar de esa complejidad y variabilidad su composición química comprende básicamente: 50-55% de resinas y bálsamos; 30-40% de cera de abeja; 5-10% de aceites esenciales o volátiles; 5% de polen; y 5% de otros materiales orgánicos y/o minerales (Sosa-López et al. 2002, Salamanca-Grosso et al. 2006, Maidana 2007).
En la fracción resinosa del propóleos se encuentran compuestos fenólicos y flavonoides que son muy importantes a nivel terapéutico (Lozina et al. 2006, Salamanca-Grosso et al. 2006, Chailliou & Nazareno 2009). Entre los compuestos fenólicos podemos mencionar: ácidos: benzoico, cafeico, cumárico, salicílico que le otorgan al propóleos sus propiedades antifúngicas y antibacterianas; la presencia del ácido ferúlico le otorga al propóleos acción hemostática y coagulante (González-Guerra & Bernal-Méndez 1997).
Los polifenoles son un grupo de sustancias químicas en donde podemos encontrar taninos, ligninas y flavonoides, que son derivados del metabolismo secundario del ácido shikímico. Según Sales et al. 2006, los flavonoides tales como flavononas, flavonas, catequinas, antocianinas, isoflavonoides y flavonoles, son considerados compuestos que le dan al propóleos la característica de ser antioxidante, antimicrobiano, cicatrizante y antiinflamatorio. Además entre los componentes presentes en los propóleos, existen ácidos y compuestos no saturados, de origen vegetal-animal, éstos tienen la capacidad de oxidarse con permanganato de potasio, que es el fundamento del método cualitativo de medición de compuestos fenólicos. Es posible suponer que esta oxidación se vincula con la presencia de ácidos no saturados de la serie grasa, con diez átomos de carbono, característicos del organismo de las abejas y de sus secreciones glandulares. El valor del índice de oxidación está condicionado, en gran parte, por los compuestos fenólicos provenientes de la fuente vegetal de la cual la abeja extrae la resina y, en menor medida, por los ácidos grasos insaturados provenientes de la abeja (Maidana 1997).
En consonancia con el uso que le dan las abejas, el propóleos es un producto de extraordinario interés para la medicina e industria farmacéutica, al que se le atribuyen efectos anti-inflamatorios, inmuno-estimulantes, hepato-protectores, antivirales, anti-fúngicos, y antioxidante (Girgin et al. 2009), anti-protozoarios, carcinostáticos, antimicrobianos, anestésicos y de regeneración tisular (Banskota et al. 2000). Numerosos investigadores aportan informaciones sobre la actividad antimicrobiana de los propóleos especialmente en el control de bacterias patógenas en humanos. Carrillo et al. (2011) informaron que los extractos etanólicos de propóleos tienen una actividad antibacteriana significativamente mayor que los extractos acuosos, y esta actividad depende de su procedencia y de la especie bacteriana evaluada. Por otro lado García-Bernal et al. (2007), también trabajaron sobre la efectividad antimicrobiana de dos extractos alcohólicos de propóleos de Cuba, siempre sobre patógenos humanos concluyendo que la efectividad antimicrobiana de los extractos depende de la procedencia del propóleos y de la especie bacteriana evaluada. En tanto Calderón-Puente De La Vega (2010) observó que todas las concentraciones de Propóleo Etanólico presentaron actividad antibacteriana, concluyendo que el Propóleo Etanólico al 15% presentó una mayor actividad antibacteriana, mientras que al 30% se observó una disminución en ésta, debido que a mayores concentraciones de Propóleo éste tiende a saturarse y por lo tanto disminuir su actividad antibacteriana.
Por último, Martínez-Galán (2009), estudió en Colombia la actividad de los propóleos contra los hongos fitopatógenos de dos especies de Colletotrichum, además de Aspergillus spp y Penicillium spp., encontrando que las especies de Colletotrichum fueron más sensibles a los propóleos, presentando un 39% de inhibición en el crecimiento radial a concentraciones entre 1000 y 5000 ppm.
El objetivo del estudio fue comprobar el efecto fungicida y bactericida de soluciones etanólicas de propóleos procedentes de diferentes localidades de la Provincia de Misiones; considerando el índice de oxidación, el contenido de compuestos fenólicos y tipo de vegetación predominante en las distintas zonas, y su efecto en la actividad antimicrobiana de los tipos de propóleos.
Se seleccionaron tres áreas de la provincia de Misiones para la recolección de las muestras de propóleos.
Área 1: EL SOBERBIO.Ubicado a una latitud de 27° 17' S y una longitud de 54° 13' O a orillas del río Uruguay, a una altura de 184 a 200 msnm; presenta temperaturas medias de 21.2 ºC; mínimas de 0 ºC; máximas de 39.2 ºC y precipitaciones de 1677 mm.
Área 2: ELDORADO.Se ubica en los 26º 23´ 60” Latitud S y 54º 37´ 60” Longitud O, a una altura de 212 a 228 msnm. El clima es subtropical húmedo, las lluvias llegan a los 2000 mm anuales. La temperatura media es de 25.4 ºC, la mínima es de 14.4 ºC y la temperatura máxima extrema registrada fue de 40 ºC.
Área 3: APÓSTOLES.Ubicado a 27º 00” de Latitud S y 55º 45´ 00” de Longitud O, a una altura de 100 a 120 msnm. La temperatura media es de 21.3 ºC; la mínima es de -3 ºC; la máxima es de 39 ºC y las precipitaciones llegan a los 1584 mm anuales.
En cada área se seleccionaron productores, dentro de un radio de 10 Km, que utilizaban colmenas modelo Langstroth, con colonia de abejas de ecotipo salvaje, que presentaban una población entre 80000 a 100000 abejas, es decir una colmena fuerte. Por esta razón en la zona de El Soberbio se trabajó con 7 productores y 29 colmenas, en Eldorado con 7 productores y 17 colmenas, en la zona de Apóstoles con 9 productores y 36 colmenas.
Extracción de muestras de propóleos. Para la extracción de propóleos, se colocaron en la tapa de la colmena una malla de plástico tipo mosquitero. Una vez que estaban cubiertas con propóleos, se las ubicaba en bolsas de plástico transparente, que posteriormente se introducían en bolsas de plástico negro, para evitar los efectos del sol. También se extrajo propóleos por raspado utilizando un cuchillo de acero inoxidable, procediéndose con mucho cuidado tratando de no incorporar pinturas ni restos de madera, de cabezales, tapa y entre tapa de las colmenas.
Todas las muestras fueron expuestas durante 1 h a -10 ºC, para matar restos de polillas de las ceras si las hubiera. Luego se pesaron y en algunos casos se procedió a la mezcla de los propóleos procedentes de las mallas, ya que la cantidad recolectada es escasa y resulta insuficiente para realizar los distintos análisis.
Relevamiento de la vegetación. El estudio de la vegetación consistió en la confección de una lista de las especies presentes en cada sitio elegido para la recolección del propóleos, que después fueron relacionadas con la flora descripta por Martínez-Crovetto (1963), es decir, aquella que existía antes de las intensas acciones antrópicas deforestadora y de introducción, y la situación actual que revela que las modificaciones han sido sustanciales.
El relevamiento de la vegetación se realizó durante los meses de julio, octubre y enero de los años 2009 al 2012, tomándose un círculo de aproximadamente 15 Km, alrededor de los apiarios, complementado con los datos suministrados en forma no oficial por técnicos de los Ministerios de Ecología y del Agro y la Producción de la Provincia de Misiones. Los testigos se encuentran depositados en el herbario del IBONE-UNNE. Corresponden a las etiquetas Sosa-Vanni.
Se realizaron las siguientes determinaciones:
Índice de oxidación. Se utilizó el protocolo descripto en el Código Alimentario Argentino Cap. XVII, Art. Segundo, con modificaciones menores.
i) Se pesó 0.2 g de propóleos que fueron colocados en mortero agregando 10 ml de etanol de 96º, se llevó a volumen de 100 mL con agua destilada y luego se filtró, ii) Con una pipeta se tomaron 2 mL de la solución diluida y se trasvasó a un vaso de precipitado de 50 mL, se agregó 1 mL de ácido sulfúrico al 20 % y luego se mezcló durante un minuto, iii) Se agregó una gota de solución de permanganato de potasio 0.1 N. Trabajando a una temperatura de 18 y 22 ºC, se midió el tiempo de desaparición del color rosado de la solución. Un término medio de 22 seg como máximo indica propóleos de buena calidad. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.
Cuantificación de los compuestos fenólicos. El método utilizado propuesto por CEDIA-UNSE (Maldonado 2000) permite cuantificar los compuestos fenólicos totales presentes en el propóleos y se lo expresa como equivalentes de ácido gálico. Se basa en la formación de quelatos entre los compuestos polifenólicos del propóleos y el ión férrico del cloruro férrico.
Para la cuantificación se colocó 1 g de muestra de propóleos en bruto en un mortero, añadiendo 10 mL de etanol, se disolvió y filtró.
Se determinó por espectrofotometría utilizando el espectrofotómetro de absorción molecular Marca Perkin Elmer, modelo Lambda 25.
Ensayos de control de hongos fitopatógenos con extractos etanólicos de propóleos. Todas las muestras de propóleos en bruto (Figura 1) se molieron en morteros de porcelana previamente esterilizados en autoclave, adicionando paulatinamente el alcohol hasta lograr una solución homogénea. En esta etapa se emplearon propóleos en bruto, es decir aquellos conteniendo diferentes proporciones de ceras u otras sustancias componentes y/o extrañas.
Por otro lado, con 24 h de antelación se prepararon tandas de 18 placas de Petri con agar-papa-glucosado (APG) al 2 % y pH 7. Luego este medio agarizado una vez frío y seco, fue perforado con sacabocados de 5 mm de sección, obteniéndose en cada placa 4 hoyos equidistantes.
A continuación, en cada hoyo realizado en el medio de cultivo con la ayuda de una pipeta graduada de 1mL, se vertió 0.1 mL de los extractos etanólicos, ya sea al 2, 4, 6, 8 y 10 %. Estas diferentes concentraciones constituyeron cada uno de los tratamientos. El experimento se planificó y cumplió con 3 repeticiones, con sus respectivos testigos, utilizándose para tal fin medios de cultivo con soluciones etanólicas sin la adición de propóleos.
Como inóculo se utilizó un aislamiento de hongos que se desarrolló previamente en los germinadores de semillas de arroz (Figura 2), desde donde se aisló Curvularia oryzae. Este hongo es uno de los agentes causales del manchado de grano del arroz (Ellis 1971, Ou 1985).
Previamente a su utilización se examinaron las estructuras fúngicas al microscopio para determinar su identidad. Una vez seleccionada la cepa se la subcultivó a una caja de Petri donde se la dejó crecer hasta cubrir aproximadamente toda su superficie (5 días).
Para el tratamiento experimental las cajas previamente preparadas con APG estéril se perforaron con el sacabocado (4 hoyos por caja) y se inocularon en su centro con un disco de inóculo fúngico de C. oryzae preparado. A la vez en cada caja se incorporó en cada hoyo 0.1 ml de la solución de propóleos.
Las placas se incubaron luego en estufa de cultivo a 25 ºC de temperatura, durante 10 días, tiempo en el cual se realizaron las mediciones del crecimiento fúngico.
Para la lectura del tamaño del crecimiento fúngico se hicieron mediciones del diámetro con una escala milimetrada y a la vez se observó la posible formación de halos de inhibición. Estas mediciones se realizaron al tercer y octavo día.
Con los datos obtenidos se procedió a realizar un análisis de varianza. (Calzada-Benza 1970.)
Ensayos de control de bacterias fitopatógenas con extractos etanólicos de propóleos
Por otro lado, para comprobar experimentalmente el comportamiento de los extractos de propóleos en el manejo de enfermedades bacterianas de vegetales, se empleó una cepa de bacterias causantes de podredumbres en semillas de arroz (Figura 4) del género Bacillus sp.
Se realizaron primero aislamientos en placas de Petri, partiendo de semillas de arroz que manifestaron síntomas, una vez puestas en cámaras de germinación empleando el método en papel filtro (blotter test).
Para comenzar las tareas de laboratorio se esterilizó todo el material instrumental en autoclave o flameo por mechero Bunsen, para una mayor asepsia, el lugar se asperjó con una solución diluida de hipoclorito de sodio al 2.5 %.
Las semillas fueron previamente desinfectadas con alcohol de 70 %, que se pasaron luego por hipoclorito de sodio al 2.5 %, enjuagando finalmente en agua destilada estéril, durante un minuto cada lavado con agitación manual enérgica.
Luego de escurridas sobre papel absorbente las semillas se pasaron en forma aséptica a las bandejas de incubación, cuyo fondo estaba recubierto con doble capa de papel de filtro húmedo.
Se usó un recipiente cerrado con el fin de mantener una humedad elevada y asepsia; manteniendo una distancia entre las semillas de 20 mm. Las bandejas se incubaron luego durante 72 h en estufa a 25 ºC.
Al cabo de ese tiempo las semillas que manifestaron síntomas de bacteriosis se separaron del resto y se procedió a aislar la cepa bacteriana presente en las mismas.
En un tubo de ensayo con 10 mL de agua esterilizada se preparó una suspensión de bacterias desde las semillas enfermas y con tal suspensión se procedió al estriado con una pipeta Pasteur sobre medio de cultivo.
El medio utilizado para las siembras fue el agar papa glucosado (APG) al 2 %, pH 7.0 en placas de Petri.
Las placas sembradas se incubaron en estufa de cultivos a temperatura constante de 27 °C durante 48 h.
Para la obtención de aislamientos puros, se realizaron diluciones de las cepas así obtenidas, pasándolas a tubos con agua destilada estéril, con relaciones 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10.000.
Los tubos se dejaron reposar a temperatura ambiente durante una hora y se procedió luego a estriar cada dilución en placas del mismo medio APG. Nuevamente se incubaron las placas a 27 °C durante 48 h.
De las bacterias que se desarrollaron en el cultivo de medio agarizado, se repicaron nuevamente a placas para su multiplicación, subcultivando también a un tubo de ensayo con medio de cultivo inclinado (en pico de flauta) para control y resguardo de la cepa pura.
A la vez que se preparaban las bacterias para el ensayo de control se procedió a preparar las suspensiones etanólicas de propóleos de tres procedencias diferentes (El Soberbio, Apóstoles y Eldorado). Cada una de tales suspensiones de propóleos a su vez se diluyó al 2, 4, 6, 8 y 10 % respectivamente. De la misma forma que en los ensayos con hongos.
A fin de conocer el comportamiento antibiótico bactericida de los propóleos sobre las cepas bacterianas, se procedió a cumplir con las pruebas experimentales de control de la siguiente manera:
Técnica de microdifusión en agar
Se vertió el medio de cultivo en las placas de Petri dejando éstas reposar en el flujo laminar durante al menos medio día, a fin de que se seque la humedad de condensación.
Luego cada una de las cajas se perforó con sacabocados de 0.5 cm esterilizado previamente, haciendo 4 hoyos por caja.
Bajo el flujo laminar se vertió la suspensión de propóleos, de cada procedencia en sus diferentes concentraciones dentro de los hoyos de las placas de Petri con el medio agarizado y las placas se dejaron secar durante 48 horas en estufa de cultivo a 25 ºC.
Se aclara que el secado se cumplió en estufa de cultivos con las cajas cerradas e invertidas para evitar contaminaciones.
Una vez secas estas cajas fueron inoculadas con las suspensiones conocidas de bacterias recién preparadas, y las placas del ensayo fueron nuevamente puestas a incubar por 72 y 120 h respectivamente en cada oportunidad antes de su examen y medición de crecimiento bacteriano. Este ensayo se repitió tres veces.
Para los diferentes tratamientos se emplearon 15 cajas de Petri preparadas con el medio de cultivo, a las cuales se le practicaron las perforaciones respectivas y se les aplicaron las distintas suspensiones de propóleos, repitiéndose esto para el propóleos de cada una de las tres localidades de procedencia.
Como tratamiento testigo se prepararon 3 placas con el medio agarizado, las que se inocularon únicamente con la suspensión de bacterias preparadas a tal fin sin el aditivo de propóleos. En su lugar se vertió 0.1 mL de etanol o agua destilada estéril.
Para la inoculación delas bacterias al medio se siguió el método de turbidez equivalente al tubo de 0.5 en la escala Mac Farland, que es equivalente a 1.5 x 108 UFC / mL.
Análisis estadísticos: Se realizó un análisis de varianza (ANOVA), con el programa INFOSTAT 2008.
A. Flora de cada área de estudio
El Soberbio. Los establecimientos visitados se encuentran en el distrito que Martínez-Crovetto (1963) llamó “Distrito de los helechos arborescentes”. Este distrito se ubica sobre la vertiente oriental de la sierra Central, limitando al norte con el Sector Planaltense y al este y sur con el Distrito de los laureles.
En esa época, este distrito aún podía ser considerado como una selva en equilibrio, caracterizada por Martínez-Crovetto (1963), como una selva mixta de laurel y guatambú, con la variante de que aquí se presentaban cuatro especies de helechos arborescentes pertenecientes a la familia de las Cyatheaceas, con troncos que llegaban hasta los 5 m de altura. Esta población se encontraba en lugares protegidos por árboles de alto porte, cerca de cursos de agua.
La acción antrópica alteró la selva, y estos helechos desaparecieron porque no soportan el exceso de luz y la exposición al sol. Si se destruye la selva, por talado o razado, aparecen especies características que no estaban antes en el lugar, este estado de la sucesión secundaria es llamado “capuera”, del guaraní, “lugar donde crecerá el monte” (Martínez-Crovetto 1963).
Con el tiempo se desarrollaron otras especies y arbustos que permitieron el desarrollo de plántulas de especies arbóreas, este estado de la sucesión secundaria llamada “capuerón” es el que encontramos en estos predios donde los habitantes han desarrollado actividades antrópicas en gran parte de las chacras, dejando parches o grupos de especies arbóreas nativas para sombra o protección.
Esa mezcla de especies autóctonas con especies introducidas en el ambiente por la ocupación del hombre, son las que se pueden observar en la lista de vegetación que hemos elaborado y que se encuentra a continuación.
En esta localidad se han podido identificar los siguientes representantes de la vegetación:
El dorado. Siguiendo el esquema fitogeográfico de Martínez-Crovetto (1963), esta localidad se encuentra ubicada en el “Distrito de los laureles”. En general estas selvas subtropicales se caracterizan por la dominancia de Nectandra megapotamica (Laurel negro) y Nectandra lanceolata (Laurel amarillo).
Normalmente este distrito era dominado por ambientes con un dosel continuo de selva que ha sido alterado, donde los acompañantes de mayor densidad eran los siguientes: Tabebuia heptaphylla (Lapacho negro); Cordia trichotoma (Peteribí); Patagonula americana (Guayaibí); Apuleia leiocarpa (Grapia); Dalbergia variabilis (Isapuy); Holocalyx balansae (Alecrín); Lonchocarpus leucanthus (Rabo itá); Lonchocarpus nitidus (Rabo abá); Myrocarpus frondosus (Incienso); Parapiptadenia rigida (Anchico colorado); Peltophorum dubium (Ibirá pitá); Ocotea puberula (Laurel negro); Nectandra lanceolata (Laurel amarillo); Nectandra megapotamica (Laurel); Cabralea canjerana (Cancharana); Cedrela fissilis (cedro); Balfourodendron riedelianum (guatambú blanco); Diatenopteryx sorbifolia (María preta); Chrysophyllum gonocarpum (Guatambú blanco); Chrysophyllum marginatum (cedro); Prunus subcoriacea (Aguay)
En la actualidad, por explotación la vegetación está alterada y reducida a los representantes que determinamos y detallamos más abajo. En esta lista se observa una marcada reducción en la riqueza florística de las especies arbóreas, las cuales quedaron limitadas a pequeñas isletas de selva con mayor o menor grado de alteración, pero se agregan especies que empiezan a predominar. Es muy difícil determinar el grado de presencia de estas especies dado que en la actualidad todavía se siguen explotando algunas de interés maderable, como cedro y cancharana, entre otras.
Apóstoles. La zona bajo estudio está comprendida en el extremo sur de la provincia de Misiones, faja ocupada por el “Distrito del urunday” (Martínez-Crovetto 1963), limitando con el “Distrito de los campos”. Toda la región ha sufrido una modificación importante en cuanto a vegetación, encontrándose en una sucesión secundaria mantenida por la acción antrópica y con representantes de lo que el citado autor llamó integrantes de la “capuera”.
Puede considerarse como una zona de transición entre ambos distritos donde la vegetación arbórea se encuentra casi exclusivamente representada por Schinus molle y Lithraea molleoides, como las especies más conspicuas y de mayor “presencia”, ambos eran acompañantes más notables del “urunday”, Astronium balansae, hoy ausente y casi en extinción. Los lugares inundables se encuentran totalmente ocupados por Cephalanthus glabratus, “sarandí”.
Actualmente encontramos una mezcla importante de plantas cultivadas y propias de ambientes alterados que se describen a continuación.
B. C. A continuación se presentan los resultados obtenidos en las determinaciones de índice de oxidación y contenido de compuestos fenólicos.
D. Los resultados obtenidos en los ensayos de control sobre hongos y bacterias fitopatógenas son los siguientes:
A. Relevamiento de la vegetación. En las tres áreas estudiadas la vegetación ha sido modificada antrópicamente y en forma diferente. En las áreas de influencia de los apiarios se distinguen:
Área de El Soberbio: con menor forestación o cultivo, hay presencia de cítricos y mayor superficie forestada con eucaliptos que pinos.
Área de Eldorado: con importantes forestaciones de pino y eucaliptos en relación uno a uno, zonas de campo y capuera.
Área de Apóstoles: amplias forestaciones de eucaliptos y menor de pinos.
B. Índice de Oxidación. De acuerdo a los resultados de los ensayos, se encontraron diferencias significativas entre las distintas localidades. El propóleos de la localidad de Apóstoles presenta un alto Índice de Oxidación (18.42 s) a diferencia de El Soberbio (7.37 s) y el propóleos de la localidad de Eldorado se distingue con el valor más bajo (1.3 s), siendo por lo tanto el mejor respecto a esta característica.
Maidana (1997) clasifica a los propóleos en bruto de acuerdo al Índice de Oxidación en tres tipos. Según esa clasificación en este trabajo el propóleos de Eldorado es de tipo “A” (0 -1.5 s); mientras que el de El Soberbio y Apóstoles es del tipo “C” (5.1-12.0 s).
C. Cuantificación de compuestos fenólicos: En el contenido de compuestos fenólicos no se observó diferencias significativas entre las tres zonas bajo estudio, como puede observarse en la Tabla 2.
El contenido de estos compuestos fenólicos supera el valor mínimo de 5%, establecido en el Reglamento Brasileño de calidad de propóleos (Ministerio de Agricultura de Brasil-APACAME 1999).El contenido promedio de compuestos fenólicos totales que se encontraron en los propóleos analizados fue del 13.61% y es superior al 12.33% del Parque Chaqueño, establecido por Maidana 1997, igualmente también supera el valor de 16.07% de la región Noroeste, obtenido por Maldonado 2000, esta diferencia se debe probablemente a las diferentes especies botánicas que las abejas utilizan como fuente de resinas.
D. Control de hongos fitopatógenos: A diferencia de lo encontrado por (Sánchez & Acebedo 2001), no se observó que las concentraciones ensayadas de los distintos propóleos probados hayan sido efectivas en el control de la cepa patógena utilizada en este trabajo, ya que en general no fue diferente a los testigos tanto en solución con etanol y acuoso (Tabla 18). También puede verse que el crecimiento fúngico en los distintos tratamientos de propóleos procedentes de las tres regiones no manifestaron entre sí diferencias aparentes en crecimiento, pero diferenciándose las tres del testigo. En el control de C. oryzae hubo diferencia con respecto al testigo, pero si bien son diferentes como se observa en la Figura 5, esas diferencias no son significativas estadísticamente.
E. Control de bacterias fitopatógenas: En la Tabla 19 se observa que todas las dosis de propóleos en extracto etanólico, presentaron diferencias significativas con el testigo, en el ensayo para control de bacterias fitopatógenas. Aplicando la técnica de microdifusión en agar no se observó crecimiento bacteriano, salvo en las placas de los tratamientos testigos, constatándose un eficiente control preventivo de los propóleos sobre las bacterias; en coincidencia con lo informado en Argentina por Solórzano et al. (2008), Londoño-Orozco et al. (2008), en México.
Los resultados preliminares obtenidos en el control de bacterias mediante el test de microdifusión fueron promisorios y por lo tanto este aspecto será tomado como objetivo de una nueva línea de investigación.
Se comprobó que en las tres áreas estudiadas la vegetación ha sido modificada antrópicamente y en forma diferente. Actualmente se compone de 18 árboles nativos, 14 especies arbustiva, 4 especies herbáceas y 7 especies introducidas en la localidad de El Soberbio, en tanto la vegetación de El Dorado se compone de 36 especies de árboles nativos, 8 especies arbustivas, 3 especies herbáceas, 1 especie de porte enredadera y 7 especies introducidas. Finalmente en Apóstoles la vegetación se compone de 7 especies de árboles nativos, 3 especies de palmeras, 12 especies arbustivas, 18 especies herbáceas y 10 especies introducidas.
El índice de oxidación, el contenido de compuestos fenólicos y la acción terapéutica en los propóleos provenientes de las tres zonas de estudio de la provincia de Misiones fueron similares.
La actividad antimicrobiana a las concentraciones ensayadas no fueron efectivas en el control de Curvularia oryzae y si lo fueron sobre Bacillus.
Los autores agradecen al Ministerio del Agro y la Producción de la Provincia de Misiones.